[发明专利]一种抗GUS蛋白质的单克隆抗体及其应用

说明书

本发明涉及一种可特异性识别GUS(β‑葡糖苷酸酶)的单克隆抗体的制备方法和其在转基因生物检测中的应用方法。目的是提供一种可检测GUS蛋白质的单克隆抗体和将该抗体用于转基因植物、动物和细胞等生物体的高灵敏度免疫学检测方法。GUS蛋白质被广泛用于基因转移报告基因，它可催化底物形成β‑D‑葡萄糖苷酸，传统方式是以分光光谱、荧光等进行检测，依赖于酶的活性，易受温度变化及加工过程的影响，一直以来缺乏一种快速有效、灵敏度高的检测方法。制备该抗体所用抗原为大肠杆菌表达的可溶性的全长GUS重组蛋白，最终获得的抗体属于IgG1a亚型，可以检测转基因植物(水稻、棉花、玉米等)、转基因动物和细胞中存在的GUS蛋白质的表达，从而对转基因生物做出鉴定。

技术领域

本发明涉及一种可以识别人GUS（β-葡糖苷酸酶）蛋白质的单克隆分子及可分泌该抗体的杂交瘤细胞系。具体而言，本发明提供了一种抗GUS分子的单克隆抗体，对该抗体重链和轻链可变区的氨基酸序列和编码可变区的DNA序列进行了确定，该抗体可以用于通过人工或自动化方式，以流式细胞术、免疫组织化学染色（IHC）、酶联免疫吸附（ELISA）或免疫印迹（Western Blot）方式检测转基因植物( 水稻、棉花、玉米等)、动物、细胞及微生物中的GUS蛋白，也可用于含GUS蛋白的生物样本富集和分离，属于生物检测和分析领域。

背景技术

GUS基因编码β-D-葡萄糖苷酶，该酶催化底物形成β-D-葡萄糖苷酸，它在植物体中几乎无背景，组织化学检测很稳定，可用分光光谱、荧光等进行检测，是目前常用的一种报告基因。但这种基于酶活性的检测方法，易受温度变化及加工过程的影响。报告基因在基因表达调控和基因工程研究中处于非常重要的地位，它是作为外源目的基因能否转化生物体的探路先锋而首先被研究的，在研究植物的基因表达调控方面起着重要的作用，现已应用到真核生物的基因调控领域中。随着基因工程技术日新月异的发展，报告基因这一探路者的作用会更明显。

随着转基因植物的不断发展及其商品化的种类不断增加，转基因生物本身的安全性以及它们对人类健康和生态环境的潜在威胁成为国际社会和广大民众广泛关注的热点问题之一。包括我国在内的越来越多的国家制定并实施了转基因食品的强制标识制度。因此，转基因产品的科学管理和应用需要得到转基因产品及其成分检测技术的支持。

目前，转基因产品及成分检测最常用的方法有两类：一类是针对其外源核酸成分的检测技术；另一类是针对其外源蛋白质成分的免疫学分析方法。基于DNA 的检测方法只能在核酸水平上反映转基因样品是否含有外源DNA，不能检测其外源基因是处于沉默还是表达状态，此类检测技术对判读外源蛋白质丰度无指导性意义。对于某些转基因植物的产品，DNA在加工过程中会降解掉而难以检测，此时，需要利用免疫分析法来检测转基因的组分。基于外源蛋白质的免疫学分析方法，采用高度特异性的抗原抗体反应，实现对转基因植物样本快速、准确、高效的检测，其技术关键是制备具有高度特异性的抗体。目前虽有抗GUS兔单克隆抗体制备的报道（沈金儿 倪庚 郑晓冬，抗β-葡萄糖苷酸酶(β-GUS)兔单克隆抗体的制备和鉴定。中国食品学报，2012，第11期），但该抗体对重组蛋白的检测限仅为50ng/mL，且并未对转基因生物进行检测而验证其应用能力。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种能针对转基因植物中常见的GUS蛋白质的广谱单克隆抗体杂交瘤及其制备方法。

本发明的第二个目的是提供一种特异性好的单克隆抗体的制备方法，该抗体 能特异结合GUS重组抗原和转基因生物。

本发明的第三个目的是提供一种将本抗体用于以水稻为代表的转基因生物检测方法。

本发明的第四个目的是提供一种利用GUS单克隆抗体与抗原的结合能力，完成表达GUS报告基因在转基因植物、转基因动物、转基因微生物、细胞或其他材料中的分选和富集方法。

解决技术问题所采用的技术手段

本发明制备了一株杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株的制备方法包括以下步骤：