[发明专利]重组梅花鹿鹿茸胸腺素β4及其制备方法和用途

权利要求书

1.一种重组梅花鹿鹿茸胸腺素β₄，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID No.2所述。

2.一种重组梅花鹿鹿茸胸腺素β₄，其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID No.1所述。

3.一种如权利要求1所述的重组梅花鹿鹿茸胸腺素β₄的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）梅花鹿鹿茸胸腺素β₄基因的克隆：采用改良的Trizol法提取鹿茸总RNA。设计及合成梅花鹿鹿茸胸腺素β₄特异引物，上游引物为5′—CATGCCATGGCCTCTGACAAGCCCGATAT—3′，下游引物为5′—CCCTCGAGCGACTCGCCTGCTTGCT—3′，通过RT-PCR方法扩增得到胸腺素β₄基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所述，全长为135bp，与载体pMD18-T连接，获得重组载体pMD18-T-Tβ₄，将其转化至E.coli DH5α感受态细胞中，用EcoR I和Sal I双酶切鉴定并进行测序验证；

（2）梅花鹿鹿茸胸腺素β₄原核表达载体的构建：用Ncol I和Xhol I将测序正确的重组载体pMD18-T-Tβ₄和表达载体pET-28a分别进行双酶切，连接后转化至E.coli BL21感受态细胞中，双酶切鉴定并进行测序验证；

（3）梅花鹿鹿茸胸腺素β₄的表达和纯化：将构建成功的表达载体pET-28a-Tβ₄转化到宿主菌E.coli BL21中，用IPTG诱导表达，采用镍离子亲和层析进行分离纯化，并用Sephadex G-25凝胶层析除盐，收集除盐后的样品，冷冻干燥即得。

4.如权利要求3所述的重组梅花鹿鹿茸胸腺素β₄的制备方法，其特征在于：所述的IPTG诱导表达，IPTG诱导浓度为0.5mmol/L，诱导时间为4h。

5.如权利要求3所述的重组梅花鹿鹿茸胸腺素β₄的制备方法，其特征在于：所述的镍离子亲和层析分离纯化时，结合液为含有500mmol/L NaCl的磷酸盐缓冲液，pH7.4，洗脱液为含有500mmol/L NaCl、200mmol/L咪唑的磷酸盐缓冲液，pH7.4。

6.如权利要求1所述的重组梅花鹿鹿茸胸腺素β₄在制备对成骨细胞M3T3或软骨细胞C5.18具有促增殖作用的药物中的应用。