[发明专利]一种检测土壤中重金属污染物潜在遗传毒性的方法

说明书

技术领域

本发明属于环境健康遗传毒理学领域，具体涉及一种检测土壤中重金属潜在遗传毒性的方法。

背景技术

土壤是人类生存与发展的重要自然资源和整个陆地生态系统赖以存在的基础，又是重要的环境要素之一。“健康”的土壤对于农业可持续发展和人类的生存非常重要。但是，随着我国经济的高速发展，土壤污染的问题日益严重，严重的土壤污染特别是重金属污染已经成为目前包含城市土壤在内的许多土壤的一个共同特性，据估计我国已经有10万km²土壤被污染，而且我国土壤污染重金属中As、Cd、Cr、Hg和Pb等高毒性重金属污染严重。有研究表明重金属对生物具有较强诱变性。因此，对土壤中有害重金属污染物进行调查并对其遗传毒性的研究已迫在眉睫，甚至有人提出土壤中是否含有遗传毒性物质，应是评价土壤的主要指标。所以建立一种有效的测试方法评价土壤中重金属的遗传毒性是环境监测的一项重要工作。

对各种环境因子遗传毒性效应的生物检测在毒理学研究中已占有十分重要的地位，它们在环境污染监测及环境保护中发挥了积极的作用。大量的遗传学分析方法被用于识别生殖细胞诱变剂、体细胞诱变剂、潜在的致癌剂，以及与人类健康相关的各种各样的遗传改变，所涉及的方法已经超过200种。根据遗传毒性效应检测方法所涉及的终端指标范围，可以把它们划分为三大类。第一类检测基因突变；第二类检测染色体畸变，包括染色体结构和/或数目的异常改变；第三类测定DNA损伤的标志如DNA损伤修复的激发、DNA加合物的形成、姐妹染色单体交换、体细胞重组及DNA键断裂等。基因突变的检测主要有正向和反向两类。正向突变改变野生型基因，使得有关基因失活而表现出可检测的表型变异。相反，回复突变是通过突变使原突变子中失活的基因功能恢复，从而表现野生型表型。染色体畸变一般包括染色体结构和数目的改变，染色体结构改变包括染色体断裂、倒位、异位和重复等。检测染色体畸变通常采用细胞遗传学技术。用于检测染色体结构异常的体系一般是高等生物，尤其是哺乳动物体内及体外系统。近年来，由于分子生物学的发展和技术的进步，使遗传毒理学领域里产生了许多新的基因毒性测试方法。尽管基因突变检测额度“金标准”是直接DNA测序，而且自动DNA测序能力也有长足的进展，但测序仍然是一个比较繁琐、费用高、需要昂贵设备的工作，不适合大范围筛查基因组中DNA突变。

DNA是生物体内的遗传物质，它的稳定对于生物体的正常繁殖和生长是至关重要的。然而环境中各种理化及生物因子---如电离辐射、各种氧化剂、细菌等都可能引起DNA损伤。单细胞凝胶电泳（singe cell gel electrophoresis assay，简称SCGE，又名彗星试验，comet assay）是一个广泛用于真核生物单细胞DNA单链、双链、碱基不稳定点和修复延迟位点的量化检测手段，该方法简便、快捷、灵敏，每109Da可检出0.1个断裂等特点而得到了广泛应用。与经典的染色体畸变、微核、SCE相比，SCGE可以用于活细胞DNA检测，也能用于死亡细胞的DNA分析，使SCGE不仅可以研究低剂量下的生物效应，也可以用于研究高剂量下的生物效应；同时SCGE又可提供DNA修复能力的信息，这使得SCGE非常适合用于评价受试物的遗传效应。

单细胞凝胶电泳技术是由Ostling于1984年首创，其后又由Singh和Olive分别加以改进，形成目前的碱性和中性裂解两类方法。该技术尽管原理、方法简单，其操作过程却十分困难。在制作胶的过程中，一般要在磨毛载玻片上滴加凝胶2—3层，每次用盖玻片盖压，在揭取盖玻片时，极易损坏胶板。在其后的裂解、电泳、洗涤过程中，凝胶长时间浸泡、冲洗，即使极轻的振荡，也可能将胶板冲动漂起，胶板的损伤常至实验失败。

从理论上讲SCGE技术适合于一切真核细胞，样品细胞需要量小，细胞可以是培养的细胞系或细胞组织分离的细胞，目前已经用过的细胞有人体淋巴细胞、表皮细胞、血细胞、成纤维细胞、睾丸细胞、肿瘤细胞、动物肝脏细胞、植物的根细胞和叶片细胞及酵母细胞等。但是有关藻类的彗星实验国内外都鲜有报道。藻类是生态环境的重要组成部分，将藻类用于SCGE，拓展SCGE的研究对象。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种检测土壤中重金属潜在遗传毒性的方法，具体的说就是提供一种利用微藻DNA损伤检测土壤中重金属污染物的潜在遗传毒性的方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种检测土壤中重金属污染物潜在遗传毒性的方法，包括如下步骤：