[发明专利]一种使接穗品种获得病毒抗性的方法及RNA干扰载体pCAMBIA2300-CMV5与转基因方法

说明书

母案第一次和第二次审查意见通知书中，审查员指出母案存在多项发明，不具备单一性，因此申请人决定对母案中未获得保护的发明进行分案申请。本申请为申请号201110315208.9（发明名称：一种使接穗品种获得病毒抗性的方法及RNA干扰载体与转基因方法）的分案申请。 

技术领域

本发明涉及植物转基因技术及其应用，特别是一种使番茄接穗品种获得病毒抗性的方法及RNA干扰载体与转基因方法。 

背景技术

植物病毒是导致果树、蔬菜、花卉等园艺植物产量下降和品质变劣的重要原因,在农业生产中病毒病是仅次于真菌的第二大类病害,由于防治困难,素有“植物癌症”之称。目前植物病毒常用的防治措施有消灭病毒源和传统媒介、应用脱毒技术、药剂防治与选育抗病品种等，其中选育抗病品种是防治病毒病害最有效、最经济的方法。RNA干扰技术为基础的植物抗病技术因其高效性、特异性等特点，在植物抗病毒育种上展现了可观的前景。 

基因沉默或称RNA干扰(RNA interference；RNAi)是指由于转基因序列或外侵病毒与被沉默的内源或外源基因序列具有高度的同源性，其转录产物形成双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)结构，从而特异性地降解同源靶基因mRNA，使之发生沉默（Fire A.,Xu S.,Montgomery M.K.,et al.Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans[J].Nature,1998,391(6669):806-811）。由于其干扰作用是发生在靶基因的转录后水平，因此，也成转录后基因沉默（post-transcriptional gene silencing；PTGS）。植物RNAi具有特异性、高效性、系统性以及可遗传性等特点。可利用RNAi技术进行基因功能研究；或直接利用RNAi创造的特殊性状变异体进行植物改良。其中RNAi技术在植物病毒抗性方面取得了很好的研究成果。RNAi是真核生物中普遍存在的外源核酸（如病毒）入侵的防御机制，同时现有研究进一步表明病毒产生交叉保护是由于诱导病毒（弱株系）所产生的RNA沉默降解了具有致病性的同源病毒（强株系）的结果（Frank G.R.,Stuart A.M.and David C.B.Gene Silencing without DNA:RNA-Mediated Cross-Protection between Viruses[J].Plant Cell,1999,11:1207-1216）。利用RNAi抵抗病毒的常用策略是：选择一段植物病毒基因的序列，以反向重复序列的方式构建成转录后含发夹结构的双链RNA（hairpin RNA，hpRNA）或含内含子的ihpRNA（intron-hairpin RNA）表达载体，通过基因枪、病毒载体转染或者农杆菌介导转化整合到植物基因上，体内表达dsRNA，直接或间接诱导RNAi的产生，起到抵抗病毒的目的。而在发夹结构研究中，认为ihpRNA表达载体比hpRNA表达载体沉默效率高（Helliwell C,Waterhouse P.Constructs and methods for high-throughput gene silencing in plants[J].Methods,2003,30（4）:289-295）。 

园艺植物种类与品种繁多，通过营养繁殖途径繁衍的园艺植物后代普遍经受着病毒的威胁。目前生产中栽培的众多蔬菜，水果和花卉均有几十到上百个品种，几乎每个品种都有数种到数十种病毒病害，病毒病抑制了植物的生长、结果，降低了果品的产量、质量，甚至引起死树，植物一旦被病毒侵染,将终生带毒持久受害。利用基因工程技术针对每一个品种进 行改良，提高其抗病毒的能力，虽可行但需花费大量的人力与财力。嫁接是许多园艺植物繁殖的方法之一，绝大多数的果树和部分蔬菜采用嫁接繁殖。嫁接既能保持接穗品种的优良性状，又能利用砧木的有利特性。在应用嫁接繁殖时，一般同一种类中的不同品种采用同一砧木，甚至有些同属中的不同种类也采用同一砧木。这样一砧多用的情况，使得改良砧木品种比单独改良接穗品种要高效的多。