[发明专利]一种以柔嫩艾美尔球虫病毒RNA为载体的转染系统

说明书

技术领域：

本发明提供了一种以柔嫩艾美尔球虫病毒RNA为载体的转染系统，同时还公开柔嫩艾美尔球虫病毒的核酸序列，属于基因工程领域。

背景技术：

球虫病 （Coccidiosis）是由艾美尔属球虫引起，且危害十分严重的寄生虫病。作为一种细胞内寄生的真核生物，艾美尔球虫导致全球养禽业的巨大损失，虽经多年研究，但迄今尚无理想的防治办法，究其原因就是对球虫细胞和分子生物学缺乏详尽的了解。双链RNA（dsRNA）病毒首先在真菌中于1948年发现，此后又在许多原虫中发现了dsRNA病毒。已报道在柔嫩艾美尔球虫、斯氏艾美尔球虫、尼氏艾美尔球虫、布氏艾美尔球虫、巨型艾美尔球虫、毒害艾美尔球虫以及堆型艾美尔球虫等体内电镜观察到病毒样粒子，但目前关于柔嫩艾美尔球虫病毒的核酸序列以及基于病毒的转染系统尚未见报导。

发明内容：

本发明提供了一种以柔嫩艾美尔球虫病毒RNA为载体的转染系统。该转染系统含有多克隆酶切位点，使用方便，可将多种外源基因转入柔嫩艾美尔球虫体内，进行柔嫩艾美尔球虫的基因表达调控、生化代谢以及虫苗研制等研究。

本发明提供的柔嫩艾美尔球虫病毒的核酸序列，如SEQ ID:1所示。

本发明公开的利用柔嫩艾美尔球虫病毒RNA作转染载体，在柔嫩艾美尔球虫体内进行外源基因的表达，其特征在于：

将含外源基因和多克隆酶切位点的基因替换柔嫩艾美尔球虫病毒dsRNA的部分编码区，并在5’外编码区前端加入T7启动子，后用RNA聚合酶进行体外转录，后将其转录体电穿孔至球虫卵囊体内进行外源基因的表达。

本发明的积极效果在于：

提供了柔嫩艾美尔球虫病毒基因组dsRNA全长cDNA序列6006bp。利用柔嫩艾美尔球虫为真核生物，外源基因在柔嫩艾美尔球虫体内表达出的蛋白具有活性，所以该转染系统含有多克隆位点，为通用型转染载体，多种外源基因可在柔嫩艾美尔球虫体内表达，为研究球虫类原虫的分子生物学、细胞生物学以及虫苗研制等提供了转染系统。

附图说明

附图1为以柔嫩艾美尔球虫病毒RNA为载体的转染系统示意图；

附图2为基于病毒的绿色荧光蛋白在球虫体内表达效果。

具体实施方法：

实施例1

以柔嫩艾美尔球虫病毒RNA为载体的转染系统

如附图1所示,根据柔嫩艾美尔球虫病毒（EtRV1）基因组dsRNA的序列特征，将绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）基因替换dsRNA部分编码区，构建EtRV1与 GFP的嵌合体。柔嫩艾美尔球虫病毒的核酸序列，如SEQ ID NO:1所示。对EtRV1 dsRNA运用PCR反应将T7启动子引入到dsRNA cDNA的5′端前，运用PCR方法扩增出EtRV1的5′端377bp （包括5′端UTRs）、3′端141bp，EGFP编码区717bp三个片段，构建EtRV1与EGFP的嵌合体，并分别克隆入载体pMD-18T，得重组质粒pMD-18T-5’UTR-EGFP-3’UTR，经EcoRI与HindII?酶切线性化后，用凝胶回收试剂盒回收、定量。取约2μg 线性化质粒作为模板，应用T7 RiboMAXTM Express Large Scale RNA Production System 进行体外转录。将线性化质粒pMD-18T-5’UTR-EGFP-3’UTR体外转录体RNA（200μg）加入柔嫩艾美尔球虫未孢子化卵囊Cytomix溶液中，溶液终体积为100μl，使用Bio-Rad 1mm电转杯，以电压500V、脉冲时间0.3ms间隔100ms连续进行三次电击反应。之后冰浴20min，离心沉淀后，加500ul灭菌水，转移至24孔细胞培养板中，于28.5℃温箱中作用12h。在蓝荧光激发条件下，球虫卵囊发出绿色荧光（见附图2；A、紫外光可见光下观察。B、可见光下观察）。说明可以利用柔嫩艾美尔球虫病毒作为一种转染载体，携带外源基因在其体内表达。

SEQ ID NO:1 

<110> 吉林大学

<120>

<140>

<160> 1

<210> 1

<211> 6006

<212> DNA