[发明专利]一种检测尿液中4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸的方法

说明书

技术领域

本发明属于烟草生物碱理化检验技术领域，具体涉及一种检测尿液中4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸的方法。

背景技术

近年来，随着人们对吸烟与健康问题的广泛关注，国内外烟草行业以及卫生机构迫切需要建立一些准确评价不同人群对烟草中部分化学成分暴露程度的方法，而生物标志物法是一种公认且有效的监测各种人群暴露程度的方法。目前，国内外检测各种具体烟气化学成分在人体尿液中生物标志物的研究已经有一些报道，但数量还比较少，涉及的用途也比较窄。

研究结果显示烟草中有3000多种化学物质，烟气中有5000多种化学物质，其中相当一部分化学物质的化学结构比较相近，它们进入人体后又经过各种复杂的代谢途径，很可能代谢生成同一种物质从尿液中排出。例如：尼古丁、降烟碱、NNK和NNAL等化学结构相近，都可以经过各种代谢途径生成4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸经尿液排出体外。虽然这些物质的初始代谢途径可能差异很大，但它们经过各种代谢途径都可以生成4-羰基-4-(3-吡啶基)丁酸，后者可以再进一步被加氢还原酶还原为羟基，生成一对4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸对映异构体，分别为(S)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸和(R)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸。由于人体本身就是一个不对称化学反应的有机系统，所以普通人群尿液中(S)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸和(R)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸的浓度有明显的差异，研究结果显示，(R)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸的浓度大约是(S)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸的30～160倍。由于普通人群尿液中(S)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸和(R)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸的比例比较稳定，而其初级前体物质尼古丁、降烟碱、NNK和NNAL等与吸烟的数量或烟气的可致肺癌性相关，所以尿液中(S)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸和(R)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸的浓度比值必然反映出人体相关器官的解毒能力以及受到NNK和NNAL等有害成分的损害程度，因此检测尿液中(S)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸和(R)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸的含量以及比值具有重要意义。如何实现同时对尿样中两种4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸含量的准确检测并对两者的比值进行深入分析，现有技术中尚未有很好的解决办法。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种通过高效液相色谱-质谱-质谱联用技术准确检测尿液中(S)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸和(R)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸含量的方法，通过对两者的比值进行深入分析，为评估个体对烟气暴露程度提供一种科学的判定方法。

本发明的目的通过下述技术方案予以实现。

除非另有说明，本发明中所采用的百分数均为重量百分数。

一种检测尿液中4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸的方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）配制含有(±)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸和氘代(±)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸-d5的混合标准溶液，对羧基进行甲酯化衍生，对醇羟基进行Mosher衍生，然后对衍生化以后的混合标准溶液进行HPLC-MS-MS分析;

（2）用普通健康吸烟人群尿样中(R)-4-mosher酯基-4-(3-吡啶基)丁酸甲酯浓度远大于(S)-4-mosher酯基-4-(3-吡啶基)丁酸甲酯的特性确定对应构型物质的色谱峰保留时间，采用内标法分别建立(S)-4-mosher酯基-4-(3-吡啶基)丁酸甲酯和(R)-4-mosher酯基-4-(3-吡啶基)丁酸甲酯的标准溶液工作曲线；

（3）准确移取尿液样品于试管中，加入(±)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸-d5内标溶液和醋酸-醋酸钠缓冲溶液，混匀后的尿液上样到活化好的Oasis MCX固相萃取小柱上进行净化，对样品中的羧基进行甲酯化衍生，对醇羟基进行Mosher衍生，然后对衍生化以后的尿液样品进行HPLC-MS-MS检测。

该方法具体包括以下步骤：

（1）标准曲线建立：