[发明专利]一种检测尿液中3-羟基可替宁的方法

权利要求书

1.一种检测尿液中3-羟基可替宁的方法，其特征在于：首先配制含有(3R,5S)-3-羟基可替宁、(3S,5S)-3-羟基可替宁和(3R,5S)-3-羟基可替宁-d₃的混合标准溶液，进行HPLC-MS-MS分析并建立标准溶液工作曲线;然后在尿液样品中加入(3R,5S)-3-羟基可替宁-d₃溶液、pH6.0的磷酸纳缓冲溶液和β-葡糖苷酸酶进行酶解，再加超纯水稀释，用水相滤膜过滤后上HPLC-MS-MS检测。

2.根据权利要求1所述的检测尿液中3-羟基可替宁的方法，其特征在于：具体包括以下步骤：

（1）标准曲线建立：

以乙腈为溶剂，配制含有(3R,5S)-3-羟基可替宁、(3S,5S)-3-羟基可替宁和(3R,5S)-3-羟基可替宁-d₃的混合标准溶液，通过保留时间确定(3R,5S)-3-羟基可替宁和(3S,5S)-3-羟基可替宁的色谱峰；以HPLC-MS-MS色谱图中(3R,5S)-3-羟基可替宁的浓度与(3R,5S)-3-羟基可替宁-d₃的浓度之比为横坐标，以色谱图中(3R,5S)-3-羟基可替宁的定量离子对峰面积与(3R,5S)-3-羟基可替宁-d₃的定量离子对峰面积之比为纵坐标，建立(3R,5S)-3-羟基可替宁的标准溶液工作曲线；按同样的方法建立(3S,5S)-3-羟基可替宁的标准溶液工作曲线；

（2）尿样处理：准确移取尿样于试管中，加入(3R,5S)-3-羟基可替宁-d₃溶液，再加入磷酸纳缓冲溶液和β-葡糖苷酸酶，充分混匀后置于恒温振荡器中或置于微波辅助萃取仪中，37℃避光恒温酶解；向酶解后的尿样中加入超纯水稀释，用0.2μm水相滤膜过滤，待检测；

（3）HPLC-MS-MS检测条件：

液相条件：用C18色谱柱和甲酸水溶液-甲酸乙腈溶液对样品进行分离；

质谱条件：用正离子模式进行多反应检测,分析物特征离子对如表1；

表1分析物特征离子对

化合物分子量定量离子对(m/z)辅助定性离子对(m/z)(3R,5S)-3-羟基可替宁192.2193→80193→134(3S,5S)-3-羟基可替宁192.2193→80193→134(3R,5S)-3-羟基可替宁-d₃195.2196→80196→134

（4）实际检测：使用优化后的液相色谱分离条件，对处理好的尿液样品溶液进行HPLC-MS-MS检测，使用标准溶液工作曲线计算待测尿液样品溶液中的(3R,5S)-3-羟基可替宁与(3S,5S)-3-羟基可替宁，进而换算得到原始尿液样品中的(3R,5S)-3-羟基可替宁与(3S,5S)-3-羟基可替宁含量，再计算得到该尿样中(3R,5S)-3-羟基可替宁与(3S,5S)-3-羟基可替宁的比值。