[发明专利]可进行蛋白质即时定位的多功能载体

说明书

技术领域：

本发明涉及一种基于碳纳米材料的多功能载体，此载体可进入细胞、可俘获蛋白质，可进行荧光追踪、可进行细胞内蛋白质定位，提高了蛋白质作用机制研究的效率和准确性。本发明属于纳米生物技术领域。

背景技术：

纳米生物技术是国际生物技术领域的前沿和热点问题，在医药卫生领域有着广泛的应用和明确的产业化前景。

蛋白质分子必须定位于细胞内部的特定位置来实现其所需的功能，因此蛋白质的亚细胞分布可调节并控制其活性。例如，多种蛋白质被合成出来之后必须定位到细胞质以外的其他地方以实现其功能，如细胞核、细胞膜、甚至细胞外的环境。这个过程是通过蛋白质上的定位信号序列完成的。即使在定位于细胞质中的蛋白质也是不均匀分布的，例如在细胞迁移和神经突触的生长过程中，特定蛋白质会聚集在生长／迁移的前端，用以保持细胞的极性。

目前，为研究蛋白质的功能及蛋白质之间的相互作用，人们通常通过基因修饰或沉默来改变其表达的蛋白质，用以研究其功能。通过在蛋白质上融合一个荧光标记，用以观察目标蛋白质。在当前的研究方法中，研究人员只能看到蛋白质的亚细胞分布，并不能自主控制蛋白质在细胞内部的即时定位。而蛋白质的细胞内分布与其功能紧密相连，不能有效控制蛋白质的即时定位，使我们不能研究原始环境下天然蛋白质的具体功能，这导致对细胞内很多作用过程只是模糊的了解，并不能进行深入的研究，甚至导致错误的结论。

因此，设计并开发出能够自主控制蛋白质在细胞内部的定位的研究工具与方法，是蛋白质功能与作用机制研究中的迫切需要。

发明内容：

针对以上技术背景，提出本发明。

要自主控制细胞内蛋白质的定位，应开发出满足如下要求的多功能载体：

(1)可进入细胞；

(2)可捕捉目标生物大分子；

(3)可对其进行荧光追踪；

(4)可对其位置进行磁场控制。

发明人在前期工作中发现，碳纳米材料在实验中表现出了极好的多功能化修饰能力，而且已经设计并开发出可分别实现上述四种功能的载体。在此基础上，本发明通过下面四种合理修饰，设计了集上述四种功能于一身的多功能载体，可实现对细胞内蛋白质的即时自主定位。

(1)修饰PEI引入正电荷，使其有效进入细胞；

(2)修饰链霉亲和素引入生物识别功能，可实现对生物素标记的目标生物大分子进行大量、专一性捕获；

(3)使用生物素标记的荧光分子进行追踪；

(4)使用生物素标记的超顺磁纳米球进行磁场控制。

本发明涉及的实现对细胞内蛋白质的即时自主定位的研究方案示意图见说明书附图1，具体表述如下：

①多功能载体的构建；

②表征载体的性质，以获得物理、化学特征；表征载体的功能，包括进入细胞能力的表征、蛋白质追踪能力的表征、蛋白俘获能力的表征、以及蛋白质定位能力的表征等；

③根据表征结果进行反馈、修正，最终获得可进入细胞、并进行俘获、追踪、定位蛋白质的的多功能载体。

使用多功能碳纳米材料控制细胞内蛋白质的即时定位示意图见说明书附图2，具体表述如下：

①进入细胞能力和追踪能力：先将带有红色荧光的多功能载体加入预先表达了生物素标记的绿色荧光蛋白的细胞。进入细胞效率通过使用荧光显微镜进行定性观测，取少量细胞采用流式细胞仪进行定量，并使用台盼蓝染色法定量测定其毒性。

②目标蛋白俘获与控制能力：载体进入细胞后，使用磁场控制多功能载体在细胞内的运动，通过荧光显微镜观察红色荧光(多功能载体)与绿色荧光(蛋白质)的运动，表征其俘获与控制蛋白质的能力。

③目标蛋白质俘获能力解析：裂解细胞，低速离心除去细胞膜等，高速离心分离载体，得目标蛋白质，并测定纯度，使用SDS PAGE电泳分析蛋白质纯度。

本发明涉及的可进入细胞，并进行俘获、追踪、定位蛋白质的多功能载体具有以下特性：

1.本发明所述的多功能载体，其特征为：以超小尺寸碳纳米材料为基本载体，该超小尺寸碳纳米材料包含但不仅限于碳纳米管、石墨烯；

2.本发明所述的超小尺寸碳纳米材料，其特征为：尺寸需小于500nm，小尺寸有利于载体在细胞内运动，并易于进行功能化；

3.本发明所述的多功能载体，其特征为：使用碳化二胺(EDC)偶联法修饰PEI引入阳离子，提供反应性大量官能团NH2，可使材料进入细胞；