[发明专利]一种梨果实纵径主效QTL位点的SNP标记方法及其应用

说明书

一、技术领域

本发明属于分子遗传育种领域，提供了梨果实纵径主效QTL位点的SNP标记方法及其应用，可用于梨果实纵径性状的早期分子辅助选择，以提高育种效率。

二、背景技术

梨(PyrusL.)原产我国，是我国第三大果树树种，因其果实营养价值高，香甜多汁，而深受消费者喜爱。果实大小是梨果综合品质的重要因素之一，纵径作为衡量果实大小的重要指标，直接影响果实的大小，从而影响了梨果实的产量，对于梨的生产应用具有重要的影响。因此，增大梨果实纵径、增加果实大小对改善梨果品质和产量至关重要，是梨育种的重要目标之一。

由于梨为多年生木本果树作物，与果实品质相关的性状大都是由多基因控制、易受环境影响的数量性状，在分离后代表现为广泛的表型变异，其基因型与表现型间的对应关系难以确定。而以往的传统育种是基于经典数量遗传学理论，把控制某一性状的多个基因作为整体进行研究和选择，在现有基础上改良目标性状难度越来较大。近年来，随着分子标记技术的迅速发展、高密度的分子遗传图谱的出现，以及数量性状作图方法的不断完善，使得数量性状基因座QTL定位变成了现实，也为提高目标数量性状优良基因型选择的可能性、准确性及预见性奠定了基础。利用分子标记定位数量性状QTL，其实质就是分析分子标记与目标性状QTL之间的连锁关系，即利用已知座位的分子标记来定位未知座位的QTL，通过计算分子标记与QTL之间的交换率，来确定QTL的具体位置。基于获得的标记基因型分离与数量性状的量之间的关系，可直接把握数量性状基因，并开发可应用于分子标记辅助选择（Molecular-assisted selection，MAS） 育种的技术，这已在许多重要农作物上取得了成功应用。

目前对梨重要品质性状纵径的QTL定位及检测QTL位点上的多态性表达果实纵径大小差异的SNP分子标记研究尚没有开展。因此，开展梨果实纵径性状主效QTL的定位，基于相应序列信息开发SNP分子标记，并建立杂交后代早期辅助选择技术体系，对于提高梨果实大小和产量等重要性状的遗传改良效率，节约生产成本显得尤为重要。

三、发明内容

技术要求

本发明的目的是定位梨果实纵径长度的主效QTL，根据贡献位点Pyb04_125序列信息开发基于高分辨率溶解曲线鉴定梨果实纵径的SNP特异标记，检测QTL位点Pyb04_125上的多态性表达果实纵径大小的差异。通过检测这些分子标记可以预测梨果实纵径长度的大小，为实现该性状的早期鉴定和筛选提供分子辅助选择技术支持。

技术方案

一种与梨果实纵径主效QTL位点紧密连锁的SNP标记引物，其特征在于：

正向引物VD-F   5’- GCATCGAAACCAACACACAA-3’

反向引物VD-R   5’- CTTCTTTCATCCATTAAACACCCA-3’

该引物用来检测梨基因组序列scaffold96.0（登录号为AJSU00000000）的第329385个碱基处存在一个与梨果实纵径相关的QTL位点Pyb04_125，同时检测QTL位点Pyb04_125上的多态性表达果实纵径大小的差异，该SNP标记位点位于第4连锁群的42.59 cM处，其解释了遗传变异的22.77%， LOD值为6.93。

所述引物用于检测与梨果实纵径主效QTL位点的SNP标记方法，其特征在于：

HRM 反应体系按照 LightCycler^? 480 High Resolution Melting Master 试剂盒中的说明书进行，HRM 分析是在LightCycler^? 480Ⅱ 荧光定量PCR 仪（Roche）上进行；

 10 μL反应体系：含有2 ng · μL^-1 梨基因组DNA 模板、1 × Master Mix、2.0 mmol · L^-1 MgCl₂、0.2 mmol · L^-1 权利要求1所述的引物；

扩增程序采用降落式PCR（touchdown PCR）：95 ℃预变性10 min，然后95 ℃ 变性10 s、60 ~ 55 ℃（每循环下降0.5 ℃）退火15 s、72 ℃ 延伸12 s的程序进行45 个循环。如果扩增产物序列大小在150bp，则表明存在一个与梨果实纵径相关的QTL位点Pyb04_125；