[发明专利]基于磁性分离和量子点标记的汞中毒快速检测方法与试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于生物与新医药技术领域。具体地，本发明提供了一种基于磁性分离和量子点标记技术快速检测尿液中汞含量的方法以及一种用于快速检测尿液中汞含量的试剂盒。

背景技术

汞(Hg)由于具有特殊的物理化学性质，其环境污染特征呈现持久性、迁移性、高毒性及生物蓄积性等四大显著特点，对人体的危害程度极大。然而，尽管汞的毒性很强，由于当前技术水平的限制，汞仍然被广泛应用于各种产品和工艺中，包括测压表、温度计、电气开关、补牙剂、电池和电石法制聚氯乙烯等。目前，人为汞污染源已广泛暴露，人类主要是通过饮食(尤其是食用鱼类产品)摄入甲基汞，通过补牙剂和职业环境的暴露摄入汞元素。与此同时，一些日用品(如，化妆品)中汞含量严重超标，进一步增加了汞中毒患者的数量。

目前，医院主要通过检测患者尿液中汞的含量，判断病人是否汞中毒。尿汞的检测方法主要有冷原子吸收分光光度法(AAS)和原子荧光光谱法(AFS)，尽管这些方法成熟，结果可信度高，但是样品需要进行复杂的前处理，不适合快速检测和大量样品的筛选。

免疫分析法是检测重金属离子的一种新方法，检测速度快、灵敏度高、选择性强，迄今为止，已经成功用于水中金属离子的检测。使用特异性的双功能螯合剂，可以螯合重金属离子并与载体蛋白偶联，形成完整的免疫原，通过杂交瘤细胞技术制备特异性单克隆抗体，将抗重金属的单克隆抗体连接到新型的Fe₃O₄磁性纳米颗粒表面，可以使Fe₃O₄磁性纳米颗粒具有靶向识别和磁性分离的双重功能，从而实现重金属的富集，提高检测灵敏度。

量子点(QDs)，又称为半导体纳米微晶粒，是一种直径在1～100nm能够接收激发光产生荧光的纳米颗粒。与传统的有机荧光染料相比，QDs具有量子产率高，光化学稳定性高，不易光解等优良的光学特性。将量子点与抗体结合用于荧光免疫分析的报道越来越多，利用亲和素修饰量子点后，量子点可以很容易的与生物素化的抗体结合，为抗体和量子点提供了一种分子连接的桥梁，应用这种方法检测毒素，可以达到用有机染料进行标记的同等的检测限。

发明内容

本发明应用杂交瘤细胞技术制备汞单克隆抗体(HgMAb)；活化的纳米磁珠和QDs分别与HgMAb和二抗相连，制备免疫纳米探针；利用免疫磁珠的可富集特性和QDs荧光信号的变化，以期建立多重信号协同放大、具有超高灵敏度的快速检测人尿液中Hg含量的新方法，具有重要的科学意义和极广阔的应用前景。

技术问题：本发明的目的在于针对目前尚无的生物样品中重金属Hg的快速检测方法，建立一种利用免疫磁珠高效分离与QDs荧光信号的变化，快速检测尿液中Hg含量的分析方法。

技术方案：本发明提供的基于磁性分离和量子点标记的汞中毒快速检测方法与试剂盒包括如下步骤：

1)Hg免疫抗原合成：Hg、双功能螯合剂[(R)-2-硫氰基-3-(4-氨基苯基)丙基]-(S-S)环己烷-1，2二乙三胺五乙酸(p-SCN-Bn-CHX-A＂-DTPA)、血蓝蛋白(KLH)按照一定比例，在三乙胺(TEA)存在下，25℃振荡反应22h；使用PBS缓冲液洗涤反应产物，并通过超滤管(30KD)滤掉未反应的小分子物质；使用上述缓冲液稀释抗原，备用。

2)Hg检测抗原合成：将Hg、p-SCN-Bn-CHX-A＂-DTPA与牛血清白蛋白(BSA)在TEA的作用下合成检测抗原。

3)抗Hg单克隆抗体(HgMAb)的制备与纯化：小鼠免疫后制备抗Hg杂交瘤细胞，然后大量制备腹水型HgMAb，最后使用饱和(NH₄)₂SO₄沉淀法进行纯化抗体，使用Sephacry S-300进一步纯化抗体。

4)抗Hg免疫磁珠(HgMAb-Fe₃O₄)制备：将HgMAb与Fe₃O₄纳米磁珠偶联，制备抗汞免疫磁珠(HgMAb-Fe₃O₄)。

5)检测方法的效果评价：分别通过标准曲线的线性范围，检出限，精密度，加标回收率实验以及与实际样品使用原子荧光分光光度计的检测结果对比，评价方法的准确性与可靠性。

有益效果：在我国汞污染严重，建立简便、快速的汞中毒快速检测方法不但对中毒病人的诊断、救治具有重要的理论意义和应用价值，还将对提高我国公共卫生管理水平和公共卫生安全事件处置能力具有重要理论意义和现实意义。