[发明专利]一种天然哺乳动物尿酸酶制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种天然哺乳动物尿酸酶制备方法，属生物工程和酶制剂技术领域。

背景技术

尿酸酶(EC1.7.3.3.，Uricase)是嘌呤代谢过程中存在的一种氧化酶，在氧气存在的情况下它能催化尿酸生成过氧化氢和5-羟基异尿酸，后者在水中会自发转化为尿囊素并放出二氧化碳。尿酸酶蛋白广泛存在于微生物(芽孢杆菌、曲霉菌)(Bayol A，Capdevielle J，Malazzi P，et al.Biotechnol Appl Biochem.2002.36(Pt1)：21-31.)、植物(豆类植物)(Lucas K，Boland MJ，Schubert KR.Arch Biochem Biophys.1983.226(1)：190-197.)及动物(哺乳动物、两栖动物)(Varela-Echavarria A，Montes de Oca-Luna R，Barrera-Saldana HA.FASEB J.1988.2(15)：3092-3096.)中。晶体衍射结果表明活性尿酸酶是由四个结构相同的尿酸酶单体非共价缔合而成的同源四聚体：首先两个单体蛋白彼此头尾相连形成环状二聚体；之后两个环状二聚体上下重叠形成四聚体(Gabison L，Chiadmi M，El Hajji M，et al.Acta Crystallogr D Biol Crystallogr.2010.66(Pt6)：714-724.)。在多种哺乳动物(小鼠、大鼠、猪、犬、羊或兔)肝脏中发现了活性尿酸酶蛋白。尿酸酶以天然结晶的形式存在于哺乳动物肝脏过氧化物酶体中，是过氧化物酶体拟核的主要组成部分；尿酸酶蛋白在核糖体内翻译后，需经复杂的定向转运过程进入过氧化物酶体(Goldman BM，Blobel G. Proc Natl Acad Sci USA.1978.75(10)：5066-5070.)，并在此过程中逐渐聚集结晶，起到降解尿酸和支撑拟核骨架的双重作用(Antonenkov VD，Grunau S，Ohlmeier S，et al.Antioxid Redox Signal.2010.13(4)：525-537.)，但该形式尿酸酶翻译后转运和聚集机制及其他生物学功能至今未知。

高尿酸血症是人体内嘌呤代谢紊乱导致的代谢类疾病，而痛风则是由慢性高尿酸血症进一步发展而形成的因尿酸结晶沉积到肾脏、关节和软组织导致的慢性疾病(Choi HK，Mount DB，Reginato AM.Ann Intern Med.2005.143(7)：499-516.)。本质上，高尿酸血症是人在进化过程中由于尿酸酶基因突变失活而引起的，突变在人尿酸酶基因编码序列中引入提前终止密码子，人类因此而不能自身合成活性尿酸酶，从而导致嘌呤分解代谢终止于尿酸(Christen P，Peacock WC，Christen AE，et al.EurJ Biochem.1970.12(1)：3-5.)。其他哺乳动物体内均存在活性尿酸酶，它可将溶解性低的尿酸盐转变为易溶的尿囊素(Shnitka TK.J Ultrastruct Res.1966.16(5)：598-625.)，由肾脏更有效的排泄。目前国内无任何尿酸酶类药物上市，国际上已上市的尿酸酶类药物有1975年法国批准上市的天然提取Aspergillus flavus来源尿酸酶(Uricozyme)(Patte C，Sakiroglu C，Ansoborlo S，et al.Ann Oncol.2002.13(5)：789-795.)、2002年FDA批准上市的重组Aspergillus flavus来源尿酸酶(Rasburicase)(Cammalleri L，Malaguamera M.Int J Med Sci.2007.4(2)：83-93.)和2010年FDA批准上市的PEG修饰重组猪源尿酸酶(Pegloticase)(Schlesinger N，Yasothan U，Kirkpatrick P.Nat Rev Drug Discov.2011.10(1)：17-18.)。Uricozyme和Rasburicase仅可用于肿瘤化疗引起的急性高尿酸血症的短期治疗，其疗效较别嘌呤醇显著(Goldman SC，Holcenberg JS，Finklestein JZ，et al.Blood.2001.97(10)：2998-3003.)，然而，由于微生物来源尿酸酶与推测出的人尿酸酶的同源性低于40％，多次给药后病人体内极易产生抗体(Pui CH，Mahmoud HH，Wiley JM，et al.J Clin Oncol.2001.19(3)：697-704.)，无法用于慢性痛风的长期治疗。Pegloticase未修饰蛋白基因来源于猪，因其与人尿酸酶的同源性高于90％，免疫原性低，经PEG长效化修饰后，可用于慢性高尿酸血症和痛风的长期治疗，具有快速消融痛风石的独特功效。