[发明专利]极地雪藻固定化保种方法

权利要求书

1.一种极地雪藻固定化保种所用软蛋白胨固体培养基，其特征在于配方如下：

A溶液：NH₄NO₃40毫克，NaNO₃5毫克，尿素5毫克，KH₂PO₄1.8毫克，Na₂SiO₃8毫克，NaHCO₃500毫克，九二0植物生长刺激素8国际单位，山梨酸钾10毫克，葡萄糖50毫克、海藻酸丙二醇酯15毫克，环己基氨基磺酸钠20毫克，蜂胶9毫克，麦芽糖醇8毫克，硬脂酰乳酸钠8毫克，焦磷酸铁4毫克，柠檬酸钾6毫克，乙酸钠5毫克，山梨糖醇液1毫升，三聚甘油单硬脂酸酯10毫克，人尿1毫升，海泥抽取液1毫升，土壤抽出液2毫升，煮沸纯净淡水1000毫升；

B溶液：即f/2微量元素溶液：ZnSO₄·4H₂O23毫克，MnCl₂·4H₂O178毫克，CuSO₄·5H₂O10毫克，FeC₆H₅O₇·5H₂O3.9克，Na₂MoO₄·2H₂O7.3毫克，CoCl₂·6H₂O12毫克，Na₂EDTA4.35克，蒸馏水1000毫升；

将上述A、B溶液煮沸消毒后，装入高压灭菌过的棕色试剂瓶中置于4℃冰箱低温保存；C溶液配制完后装入高压灭菌过的棕色试剂瓶，置于4℃低温冰箱备用；

从冰箱中取出上述A和B两种溶液进行混合，使用前两个棕色瓶均充分摇匀，取A溶液1000毫升，B溶液1毫升，混合于1500毫升的三角烧瓶中；混合液用1％的氢氧化钠溶液调节值到7.5左右，按重量比6‰的比例称重蛋白胨，加入三角烧瓶中，搅拌均匀，再加入重量比0.5‰的乙二醇，搅拌3分钟，后置于电热炉上加热融化；培养液分装于100毫升的三角烧瓶中，分装量30毫升，三角烧瓶瓶口用无菌培养容器封口膜封口；将上述配制好的固体培养基置于高压灭菌锅中灭菌，温度121℃，灭菌20-30分钟，取出冷却，即可。

2.一种极地雪藻固定化保种方法，其特征在于步骤如下：

(1)极地雪藻预先进行提纯和液体培养，以确保接种时藻种处于指数生长期；

(2)液体培养基的配制

A溶液：NH₄NO₃40毫克，NaNO₃5毫克，尿素5毫克，KH₂PO₄1.8毫克，Na₂SiO₃8毫克，NaHCO₃500毫克，九二0植物生长刺激素8国际单位，山梨酸钾10毫克，葡萄糖50毫克、海藻酸丙二醇酯15毫克，环己基氨基磺酸钠20毫克，蜂胶9毫克，麦芽糖醇8毫克，硬脂酰乳酸钠8毫克，焦磷酸铁4毫克，柠檬酸钾6毫克，乙酸钠5毫克，山梨糖醇液1毫升，三聚甘油单硬脂酸酯10毫克，人尿1毫升，海泥抽取液1毫升，土壤抽出液2毫升，煮沸纯净淡水1000毫升；

B溶液：即f/2微量元素溶液：ZnSO₄·4H₂O23毫克，MnCl₂·4H₂O178毫克，CuSO₄·5H₂O10毫克，FeC₆H₅O₇·5H₂O3.9克，Na₂MoO₄·2H₂O7.3毫克，CoCl₂·6H₂O12毫克，Na₂EDTA4.35克，蒸馏水1000毫升；

C溶液：即f/2维生素溶液：维生素B₁₂0.5毫克，维生素B₁100毫克，维生素H0.5毫克，蒸馏水1000毫升；

将上述A、B溶液煮沸消毒后，装入高压灭菌过的棕色试剂瓶中置于4℃冰箱低温保存；C溶液配制完后装入高压灭菌过的棕色试剂瓶，置于4℃低温冰箱备用；

(3)软蛋白胨固体培养基制备

从冰箱中取出上述A和B两种溶液进行混合，使用前两个棕色瓶均充分摇匀，取A溶液1000毫升，B溶液1毫升，混合于1500毫升的三角烧瓶中；混合液用1％的氢氧化钠溶液调节值到7.5左右，按6‰的比例称重蛋白胨，加入三角烧瓶中，搅拌均匀，再加入0.5‰的乙二醇，搅拌3分钟，后置于电热炉上加热融化；培养液分装于100毫升的三角烧瓶中，分装量30毫升，三角烧瓶瓶口用无菌培养容器封口膜封口；将上述配制好的固体培养基置于高压灭菌锅中灭菌，温度121℃，灭菌20-30分钟，取出冷却，次日待用。

(4)软蛋白胨固体培养基接种和培养

将软蛋白胨固体培养基放在六孔电热水浴锅中，调至42℃，此时软蛋白胨固体培养基呈液化状态；于无菌超净工作台上，用液枪吸取0.1毫升藻种液，迅速注射到呈液化状态的培养基中，摇匀，立即放到常温、流动的自来水中降温(30秒内完成)；然后将接种完毕的固体培养基置于10±1℃的培养箱内培养，光强4000-5000lx，约15-20天，可见长出的藻细胞团。

(5)低温保存

在超净工作台环境中挑选藻种群生长良好的三角烧瓶，在其表面覆盖0.2厘米厚的液体培养基(用A溶液200毫升，B溶液1毫升，C溶液1毫升混合而成的单细胞培养液)，置于-50±2℃的低温培养箱中，200-400lx弱光照射，在此培养条件下，藻种可保存6-8年。