[发明专利]一种红叶石楠高效基因转化的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种红叶石楠高效基因转化的方法，属于植物生物技术领域。

背景技术

红叶石楠(Photinia xfrasery)是蔷薇科石楠属杂交种的统称，是起源于亚热带的常绿灌木树种。春季其新叶红艳，夏季转绿，秋、冬、春三季呈现红色，霜重色逾浓，低温色更佳。做行道树，其杆立如火把；做绿篱，其状卧如火龙；修剪造景，形状可千姿百态，景观效果美丽，被誉为“红叶绿篱之王”。自上世纪九十年代引入我国以来，就被列为具有较高开发价值的彩叶树种。但由于红叶石楠不适应北方如山东、河北、北京等地的冬季低温，容易造成冻害，限制了推广和发展进程。国内研究人员对红叶石楠抗寒性、变色机理、越冬适应性等方面开展了相关研究，以期通过驯化和抗寒适应性筛选抗寒品种，但截止目前仍未选育出有效抗寒的红叶石楠品种。随着分子生物学的发展，利用基因工程技术将抗冻基因转到植物体内，培育抗寒品种成为当前木本植物抗寒育种研究的热点。

为此，通过cDNA-AFLP的差异表达分析技术，从我国西北荒漠地区仅存的常绿的木本植物沙冬青(源于远古第三纪的国家二级濒危保护植物)中筛选出13个低温诱导上调表达转录片段。对其中的一个EST片段已通过RACE获得其全长cDNA，构建了植物表达载体，转化拟南芥成功并获得了抗冻性明显提高的转基因拟南芥植株，但是转化木本植物未能成功。本发明选择另一个抗冻基因AmGS进行克隆，并通过基因枪法与根瘤农杆菌介导法相结合的遗传转化方法将它导入木本植物红叶石楠中，选育抗寒新品种。

目前的植物遗传转化技术可分为两大类，一类是以基因枪转化法为代表的直接基因转移技术，基因枪法把遗传物质或其他物质附着于高速微弹直接射入细胞、组织和细胞器，是目前国际上最先进的基因导入技术。气体基因枪以压缩气体(氦或氮)转换成的气体冲击波为动力，使气体基因枪产生一种“冷”的气体冲击波进入轰击室，因此可免遭由“热”气体冲击波引起的细胞损伤。气体基因枪可在广泛的细胞型中得到瞬时的、稳定的和高效率的转化作用。气体基因枪有一个产生冲击波的特殊结构，在恰当的气压范围内从3.5MPa-10MPa，具有相应不同的可破裂膜，将包覆DNA的粒子穿越，射入在轰击室底部的靶细胞中(最大靶直径50mm)。基因枪适用于动植物、细胞培养物、胚胎、细菌及小型动物的转基因。具有快速、简便、安全、高效的特点。另一类是生物介导的转化方法，主要有农杆菌介导和病毒介导两种转化方法，其中农杆菌介导的转化方法是目前应用最广的基因转化方法，具有操作简便、成本低、转化率高的特点，广泛应用于双子叶植物的遗传转化。本发明将两种遗传转化技术有机的结合起来，用于红叶石楠抗寒基因转化。

发明内容

本发明的目的在于提供一种红叶石楠高效基因转化的方法，以便针对红叶石楠抗寒基因进行转化。

为了实现上述目的，本发明的技术方案如下。

一种红叶石楠高效基因转化的方法，具体采用的是基因枪法和农杆菌介导法结合的基因转化方法，其步骤包括：(1)质粒DNA的提取；(2)受体材料的准备；(3)钨粉预处理；(4)微弹制备；(5)基因枪轰击；(6)受体材料的预培养；(7)农杆菌侵染；(8)共培养；(9)抑菌及卡那霉素筛选培养；(10)转化植株PCR和Southern Blotting检测。

各步骤具体如下：