[发明专利]一种产超高光学纯度R,R-2,3-丁二醇基因工程菌及其构建方法与应用

权利要求书

1.一种产超高光学纯度R,R-2,3-丁二醇基因工程菌，该工程菌是通过下列方法构建得到：利用PCR技术从多粘类芽孢杆菌CGMCC3044中扩增出丁二酮还原酶基因dar，5’端39bp碱基序列构成同源臂Ⅰ，3’端20bp碱基序列构成同源臂Ⅱ，通过多克隆位点将同源臂Ⅰ和同源臂Ⅱ分别串联到携带λRed同源重组序列克隆粘粒SuperCos-1/pIJ790的oriT复制起始序列和阿泊拉霉素抗性基因Apra^R序列的两端，得到含dar同源臂Ⅰ-oriT-Apra^R-dar同源臂Ⅱ序列的重组粘粒SuperCos-1/pIJ790-dar同源臂Ⅰ-oriT-Apra^R-dar同源臂Ⅱ，重组粘粒转化多粘类芽孢杆菌CGMCC3044，并在λRed介导下与多粘类芽孢杆菌CGMCC3044发生同源双交换，得到重组的多粘类芽孢杆菌，即产超高光学纯度R,R-2,3-丁二醇基因工程菌CGMCC3044-dar^-。

2.根据权利要求1所述的产超高光学纯度R,R-2,3-丁二醇基因工程菌，其特征在于：该工程菌通过下列方法构建得到：

（1）基因dar的克隆：根据Genebank公布的多粘类芽孢杆菌ATCC12321中dar基因的序列设计合成PCR所需的引物：

P1：5’-ATGGAACTTAAAAACAAAACAGCC-3’

P2：5’-CTGTGGGTTGGTTGTCCAAAT-3’

以多粘类芽孢杆菌CGMCC3044基因组为模板完成PCR反应：PCR反应条件：94℃变性5min，经94℃30s，56℃30s，72℃1min，共32个循环，再经过72℃延伸10min，获得的PCR产物经电泳分析确认，经PCR产物纯化试剂盒纯化后，与pMD18-T载体连接，进行序列测定，获得来源于多粘类芽孢杆菌CGMCC3044的丁二酮还原酶基因，即dar基因；

（2）重组粘粒SuperCos-1/pIJ790-dar同源臂Ⅰ-oriT-Apra^R-dar同源臂Ⅱ的构建：在dar的5’端39bp碱基序列的两端分别引入EcoR I，Xho I，得到dar同源臂Ⅰ；在dar的3’端20bp碱基序列的两端分别引入Not I，BamH I，得到dar同源臂Ⅱ；将上述dar同源臂Ⅰ和dar同源臂Ⅱ分别连接至携带λRed同源重组序列的克隆粘粒SuperCos-1/pIJ790的oriT复制起始序列和阿泊拉霉素抗性基因Apra^R序列的两端，得到含dar同源臂Ⅰ-oriT-Apra^R-dar同源臂Ⅱ序列和λRed序列的重组粘粒SuperCos-1/pIJ790-dar同源臂Ⅰ-oriT-Apra^R-dar同源臂Ⅱ；

（3）重组基因工程菌的获得：将重组粘粒SuperCos-1/pIJ790-dar同源臂Ⅰ-oriT-Apra^R-dar同源臂Ⅱ转化多粘类芽孢杆菌CGMCC3044，涂布含40μg/mL阿泊拉霉素平板，挑取阳性重组子，并进行菌落PCR鉴定，得到重组多粘类芽孢杆菌，命名为CGMCC3044-dar^-。

3.权利要求1所述的产R,R-2,3-丁二醇基因工程菌的构建方法，其特征在于：该方法包括下列步骤：利用PCR技术从多粘类芽孢杆菌CGMCC3044中扩增出丁二酮还原酶基因dar，5’端39bp碱基序列构成同源臂Ⅰ，3’端20bp碱基序列构成同源臂Ⅱ，通过多克隆位点将同源臂Ⅰ和同源臂Ⅱ分别串联到携带λRed同源重组序列克隆粘粒SuperCos-1/pIJ790的oriT复制起始序列和阿泊拉霉素抗性基因Apra^R序列的两端，得到含dar同源臂Ⅰ-oriT-Apra^R-dar同源臂Ⅱ序列的重组粘粒SuperCos-1/pIJ790，重组粘粒转化多粘类芽孢杆菌CGMCC3044，并在λRed介导下与宿主菌发生同源重组双交换，得到重组的多粘类芽孢杆菌，即产超高光学纯度R,R-2,3-丁二醇基因工程菌CGMCC3044-dar^-。