[发明专利]一种安全生产1,3‑丙二醇的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体地说，即：敲除克雷伯氏肺炎杆菌中引起潜在致病性的大片段基因，从而提高1,3-丙二醇发酵的安全性，同时对生产性能没有影响。

背景技术

1, 3-丙二醇（1, 3-porpanediol，简称1, 3-PD）是一种重要的化工原料，可用作溶剂、抗冻剂或保护剂、精细化工原料以及新型聚醋——聚对苯二甲酸丙二醇醋（PTT）和聚氨醋的单体。PTT已被证明是一种性能优异的新型聚酯材料。现有的1, 3-PD生产法有化学合成法和生物合成法。目前国际上1, 3-PD的合成主要是通过化学法进行的。但是相对于化学合成法而言，生物法合成1, 3-PD的条件更温和、操作简单、副产物少、更绿色环保。随着1, 3-PD需求量的日趋扩大，对于1, 3-PD的生物合成法的研究已越来越受到国内外研究人员的重视。

生物合成法的主要路线是在生物催化剂的作用下将甘油转化为1, 3-PD。目前，自然界中能将甘油转化为1, 3-PD的微生物大致包括：克雷伯氏肺炎杆菌（Klebsiella pneumoniae）、弗氏柠檬菌（Citrobacter freundii）、丁酸梭状芽孢杆菌（Clostridia butyricum）等等。其中克雷伯氏杆菌因生物转化效率高、生物转化过程操作方便，研究应用最多。

如：1、刘德华等，一种发酵生产1, 3-PD的高产工艺（申请号：CN200710063347.0），该方法以中间代谢产物3-羟基丙醛为控制指标来促进微生物合成1, 3-PD；2、杜铭等，氧化还原电势调控厌氧发酵生产1, 3-PD方法(申请号：CN200410048122.8)，该方法通过调控发酵体系的氧化还原电势来促进微生物合成1, 3-PD。3、宫衡等，一种转化甘油生产1, 3-PD的方法（专利号：ZL20071008）,该方法通过控制渗透压来促进微生物合成1, 3-PD。

上述方法无一例外的都利用克雷伯氏肺炎杆菌（K. pneumoniae）。但是应用克雷伯氏肺炎杆菌必须考虑的问题就是该菌的生物安全性。克雷伯氏肺炎杆菌是一种条件致病菌，是引起人体细菌感染的常见微生物。克雷伯氏肺炎杆菌中一些菌株是高度危险的，例如最近Shon报道的一株克雷伯氏肺炎杆菌，能感染体质好的年青人并危及生命（Virulence 2013(4),107-118）。目前，有关克雷伯氏肺炎杆菌致病性的研究有不少，一些致病基因，如：magA, alls, rmpA, mrkD, kfu, cf29a, fim, uge, wabG, ureA也陆续在克雷伯氏菌中发现，其中magA被认为是肺炎克雷伯菌中强力的致病基因。因而目前减少克雷伯氏菌致病性的方法主要是也是针对上述这些单个的基因 (Appl Microbiol Biot 2013(97), 1997)。

但是研究证据表明，上述基因在克雷伯氏肺炎杆菌中出现的频率与其致病性关联不大，以上述基因来区分各种克雷伯氏肺炎杆菌致病性的强弱是不够的（Environ Microbiol,2004(6),584-590）。因此，仅仅敲除上述单个基因显然不能从根本上解除人们应用克雷伯氏肺炎杆菌生产1,3-PD时，对其致病性的担忧。

发明内容

本申请的发明人在研究中发现，克雷伯氏肺炎杆菌中，一些潜在的致病基因是连续出现，并在基因组上形成比较大的片段，其中VH1、VH2片段普遍存在在克雷伯氏肺炎杆菌中。分析VH1、VH2发现这些片段中的基因都是潜在能够引起致病的基因。这些连续、呈大片段出现的致病基因群，目前还未见有研究报道。

本发明目的在于提供一种更安全的利用克雷伯氏菌生产1,3-PD的方法，即：将克雷伯氏肺炎杆菌中VH1、VH2大片段基因群敲除，从而更好地降低克雷伯氏肺炎杆菌的潜在致病性。

本发明一种更安全生产1,3-PD的方法，包括种子培养以及发酵罐发酵转化甘油生成1, 3-PD，该方法敲除基因中连续的大片段致病基因群VH1、VH2以提高克雷伯氏肺炎杆菌的安全性，从而更安全地发酵生产1,3-PD。

根据本发明，所述VH1、VH2大片段病毒基因群具体如下：