[发明专利]一种结构特异性沙丁胺醇完全抗原的合成方法

说明书

技术领域

一种结构特异性的沙丁胺醇完全抗原的合成方法，属于生物化工技术领域。

背景技术

沙丁胺醇（salbutamol），是一种短效β2肾上腺素能受体激动剂，用作平喘药。添加微量沙丁胺醇于牲畜饲料内，可以增加牲畜的瘦肉量及换肉率、减少脂肪，但是其毒性远高于具有相同功能的沙丁胺醇类似物。2002年9月10日起在中国境内禁止在饲料和动物饮用水中使用沙丁胺醇。 

 

目前我国对沙丁胺醇的检测方法主要有高效液相色谱法(HPLC)、液质联用法（LC/MS）、酶联免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)、胶体金试纸条法等。仪器分析方法存在样品须经多步稀释、过滤、提取，制备复杂、繁琐的缺点。尽管仪器方法是沙丁胺醇检测的确证方法，但是由于其操作繁琐，以及长时间的样本前处理过程，导致检测成本高，周期长，无法满足大批量样本快速筛查，以及现场快速检测的要求。ELISA和胶体金试纸条法属于免疫分析技术，具有较高的灵敏度和特异性，检测时对样本的纯度要求不高而且操作简便，适用于大量样本的现场快速检测。

影响免疫分析方法的关键因素在于特异性的抗原和抗体。传统的沙丁胺醇人工抗原一般通过琥珀酸酐与沙丁胺醇分子上的羟基偶联，衍生出羧基再与蛋白偶联。由于沙丁胺醇上有三个羟基，都能参与反应，因此使用琥珀酸酐法得到的羧基衍生物是一个混合物，最终通过免疫动物得到的抗体是针对这种混合物的，抗体的特异性和灵敏度会受到很大影响。同时，由于β2激动剂的其它药物，如克伦特罗，溴布特罗，特步他林，马步特罗，班布特罗等结构都有与沙丁胺醇一样的叔丁基侧链，因此通过羟基偶联的抗原，暴露出的位点是这几种β2激动剂的共有基团，相应免疫出的抗体不可避免的会与这些β2激动剂有交叉反应。

本发明的半抗原是在沙丁胺醇分子的叔丁基侧链一端接出活性羧基，得到单一特异性结构的沙丁胺醇羧基衍生物，该衍生物为沙丁胺醇半抗原，将半抗原与载体蛋白偶联最后形成完全抗原。

发明内容

本发明的目的：针对现有沙丁胺醇抗原合成技术以及相应抗体的不足和缺陷，提供一种新型的结构特异性沙丁胺醇半抗原和完全抗原合成方法，使得制备高特异性的沙丁胺醇单克隆抗体成为可能。

本发明的技术方案：一种沙丁胺醇完全抗原的合成方法，其合成路线为：

工艺步骤为：

（1）沙丁胺醇半抗原的制备：

合成一种小分子化合物作为沙丁胺醇半抗原，名称为4-((2-羟基-2-(4-羟基-3-(羟甲基)苯基)乙基)氨基)戊酸，其分子结构式如式I所示：

式I；

制备步骤：将2-溴-1-[4-羟基-3-(羟甲基)苯基]乙-1-酮溶解于丙酮，加入碳酸钾后，与二苄基胺反应生成化合物B，在氢化铝锂催化下，生成化合物C，再在Pd/C催化下和氢气生成化合物D，再与乙酰丙酸乙酯还原胺化反应生成化合物E，在碱性条件下水解，最后于酸性条件下重结晶后生成式I所示沙丁胺醇半抗原；

（2）沙丁胺醇完全抗原的制备：

方案A：将沙丁胺醇半抗原，用DMF溶解，与NHS、EDC反应，式I所示化合物:NHS:EDC的摩尔比为1: 1.5: 2，在4℃下、避光搅拌反应1h，再在室温下反应12h；取载体蛋白，沙丁胺醇半抗原与载体蛋白的摩尔比为80:1，用0.1M pH9.6 碳酸盐缓冲液溶解，其中溶解后的蛋白浓度大于3mg/mL，且碳酸盐缓冲液与DMF的体积比例为5:1；将活化的半抗原溶液慢速滴加到蛋白溶液中，室温下反应24h，用PBS缓冲液透析2天，期间换液4次，即得到沙丁胺醇完全抗原；

或方案B：将沙丁胺醇半抗原，用DMF溶解，与三正丁胺、氯甲酸异丁酯反应，半抗原: 三正丁胺: 氯甲酸异丁酯的摩尔比为1: 1.2: 1.2，0℃反应1h；取载体蛋白，半抗原与载体蛋白的摩尔比为80:1，用 0.1M pH9.6 碳酸盐缓冲液溶解，0℃预冷30min，其中溶解后的蛋白浓度大于3mg/mL，且碳酸盐缓冲液与DMF的体积比例为5:1；在0℃条件下，将活化的半抗原溶液慢速滴加到蛋白溶液中，0℃条件下反应1h，然后室温下反应24h，用PBS缓冲液透析2天，期间换液4次，即得到沙丁胺醇完全抗原。

所述的沙丁胺醇完全抗原的合成方法，所述载体蛋白为牛血清白蛋白BSA、匙孔血蓝蛋白KLH、血蓝蛋白LPH、鸡卵清白蛋白OVA、人血清白蛋白HAS之一种。