[发明专利]耐盐并具有低温生物脱氨功能的枯草芽孢杆菌及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种在低温条件下具有高脱氨活性的细菌﹑培养该细菌的方法﹑以该菌为主要组成成分的低温生物脱氨剂的制备﹑及运用该制剂在水体氮素降解中的应用。

背景技术

氮素循环是自然界中最为重要的生态系统物质循环的组成之一。然而，氮肥的使用及高密度水产养殖的发展，在带来巨大经济效益的同时也造成了严重的环境问题。在水产养殖中，因氮磷元素含量过高而造成的富营养化情况频繁出现，除使水质恶化及破坏其中的生物平衡外，其中的氨氮和亚硝态氮对养殖动物具有较强毒性，特别是氨氮（NH₄⁺—N），它能直接或间接影响鱼类的生长﹑繁殖乃至死亡，一方面它能被植物直接吸收利用，增加浮游生物量，为鱼类提供更丰富的营养饵料。另一方面它对鱼类及其他水生动物有毒性，它能破坏鳃组织，并渗进血液中，降低血液载氧能力，使呼吸机能下降。

已有研究报道表明假丝酵母、诺卡氏菌、光合细菌、硝化细菌等对养殖水体中的氨氮具有较强的去除能力，但存在接种量大、应用成本高等缺点，而芽孢杆菌易分离、易培养，该类微生物不仅可产生多种胞外水解酶，分解水中残留的有机物，还可产生休眠芽孢，能够抵御恶劣环境，方便制剂加工和储运，在降低水体氨氮含量和调节水质方面有良好的应用前景。

枯草芽孢杆菌除了对氨氮有较好的脱除能力外，还能产生大量的胞外酶类，从而大量消耗池塘中的残饵和动物排泄物等大分子有机质。大分子有机质被分解为小分子有机酸、氨基酸等物质，能为水体中光合细菌、藻类以及其它浮游生物提供营养，客观上促进了微生态环境的稳定；芽孢杆菌还可使水生动物的肠道pH降低，产生较强活性的蛋白酶和淀粉酶，促进水生动物的消化；此外，芽孢杆菌定植在目标动物肠道中，经生物夺氧作用，能抑制病原菌的滋生以及提高动物的免疫力，最终预防疾病的发生，最终促进目标动物生长和提高饲料转化率。

目前已报道的枯草芽孢杆菌大多存在氨氮的脱除能力不强，对环境温度要求高（25℃以下氨氮脱除能力不强），菌株存活率不高，生产成本大，菌株在高盐度水体中脱氮活性低等问题，影响了枯草芽孢杆菌在环境保护中的应用。

发明内容

本发明公开了一株具有低温脱氨生物活性的细菌：枯草芽孢杆菌DA-1，该细菌具有较高的氨氮脱除能力。这类菌株是好氧细菌，在生物脱氮中能有效地将NH₄⁺-N直接转化成菌体的自身组成物质，更具体地，这类细菌是芽孢杆菌属的一类细菌，由发明人在江苏省南京市钟山风景区琵琶湖畔采集的土壤中筛选得到。本发明公开的细菌是枯草芽孢杆菌DA-1，分类命名：枯草芽孢杆菌，Bacillus subtilis。其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号是：CGMCC No.8292。保藏时间：2013年10月08日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学研究微生物研究所。

在低温条件下，本发明的DA-1仍具有较高的氨氮脱除能力。

本发明的DA-1可以在15～30℃，120～250r/min的摇瓶转速，pH5～10的条件下，在每升含10～25g葡萄糖、1～3g可溶性淀粉、10～40g黄豆饼粉、20～40mg硫酸锰、0.1～0.4g酵母膏、0.1～0.3g三氯化铁和0.1～0.3g碳酸钙的培养基中进行培养。

更优选的培养方法是：本发明的DA-1在30℃，200r/min的摇瓶转速，pH7.0的条件下，在每升含15g葡萄糖、2g可溶性淀粉、30g黄豆饼粉、30mg硫酸锰、0.2g酵母膏、0.1g三氯化铁、0.1g碳酸钙的培养基中。

上述培养基中，灭菌条件优选：121℃灭菌20min，葡萄糖单独115℃灭菌15min后加入无菌培养基中。固体培养基中需加入1.5%琼脂粉。本发明所述百分比均为重量百分比。

本发明还公开了DA-1的高密度发酵方法，通过液体深层发酵，该细菌能够形成大量芽孢，在氨氮污染水体中单独使用该生物脱氮剂可有效脱除水体中氨氮。

本发明公开了一种大规模高密度培养低温脱氨芽孢杆菌DA-1的方法，包括：在30℃，搅拌转速200～300r/min，通气量0.3～0.8vvm，接菌量3～6%，初始pH7.0的条件下，在每升含10～25g葡萄糖、1～3g可溶性淀粉、10～40g黄豆饼粉、20～40mg硫酸锰、1～3g磷酸氢二钾、1～2g磷酸二氢钾、0.2～1.0g硫酸镁、0.1～0.5g酵母膏、0.1～0.3g三氯化铁和0.1～0.3g碳酸钙的培养液中进行发酵罐培养细菌。