[发明专利]一种包含HCV和HIV核酸片段的人工双元假病毒颗粒的制备方法

权利要求书

1.一种包含HCV和HIV核酸片段的人工双元假病毒颗粒的制备方法，其特征在于：该制备方法包括如下步骤：

（一）MS2成熟蛋白基因和包膜蛋白基因的克隆

（1）设计合成大肠杆菌噬菌体MS2成熟蛋白基因、包膜蛋白基因和Pac site的上下游引物，上游引物序列为5'-CCATGG TCCTGCTCAACTTCCTGTCGAGC-'3（SEQ No.1）；下游引物序列为5'-GGATCC TGTCTTCGACATGGGTAATCC-'3（SEQ No.2）；

（2）以MS2噬菌体RNA作为模板，用上述引物进行RT-PCR扩增，最后将扩增产物连接到pMD18-T载体上进行测序，验证克隆的正确性；

（二）假病毒表达载体pET-28b/MS2的构建

（1）提取上述含有MS2成熟蛋白基因、包膜蛋白基因和Pac site的pMD18-T质粒，然后使用NcoI和BamHI限制性内切酶将插入的成熟蛋白基因+包膜蛋白基因+Pac site片段分离下来，将其与经过NcoI和BamHI双酶切后的pET-28b载体进行连接，得到连接产物；

（2）将上述连接产物转化大肠杆菌DH5ɑ，挑取阳性克隆进行培养，然后提取质粒用NcoI和BamHI进行双酶切鉴定，酶切结果能够分离出1700bp左右片段的，为正确的阳性克隆；

（三）双元假病毒表达载体pET-28b/MS2/HCV+HIV的构建

（1）以HCV5'UTR和HIV-15'LTR区域序列为制备假病毒的目标序列，其中HCV5'UTR序列长度为230bp，HIV-15'LTR序列长度为250bp；

（2）人工合成含有HCV和HIV-I的基因片段，片段序列为：

5'-ATGGATCCCAGCCTCCAGGACCCCCCCTCCCGGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAACCGGTGAGTACACCGGAATTGCCAGGACGACCGGGTCCTTTCTTGGATCAACCCGCTCAATGCCTGGAGATTTGGGCGTGCCCCCGCAAGACTGCTAGCCGAGTAGTGTTGGGTCGCGAAAGGCCTTGTGGTACTGCCTGATAGGGTGCTTGCGAGTGCCCCGGGAGGTCTCGTAGACCGTGGGACTGGGGAGTGGCGAGCCCTCAGATGCTGCATATAAGCAGCTGCTTTTGCCTGTACTGGGTCTCTCTGGTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAGCTAGGAAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTTAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCAGTGGCGCCCGGGATCCAT-'3（SEQ No.3），其中CAGCCTCCAGGACCCCCCCTCCCGGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAACCGGTGAGTACACCGGAATTGCCAGGACGACCGGGTCCTTTCTTGGATCAACCCGCTCAATGCCTGGAGATTTGGGCGTGCCCCCGCAAGACTGCTAGCCGAGTAGTGTTGGGTCGCGAAAGGCCTTGTGGTACTGCCTGATAGGGTGCTTGCGAGTGCCCCGGGAGGTCTCGTAGACCGTG为HCV5’UTR序列，其他为HIV-15'LTR序列；

（3）使用BamHI限制性内切酶将上述片段进行酶切，然后将其正向连接进入经过BamHI酶切后的pET-28b/MS2载体中，得到连接产物；

（4）将上述连接产物转化大肠杆菌BL21（DE3）中，挑取阳性克隆进行培养，然后提取质粒用BamHI和SacI进行双酶切鉴定，将正向连接的克隆作为正确的阳性克隆；

（四）诱导表达和纯化

将上述含有pET-28b/MS2/HCV+HIV的阳性克隆接种在含卡那霉素的SOB液体培养基中振荡培养过夜，在培养基中添加IPTG来进行诱导表达；离心收集菌体，再进行超声碎菌处理，将细菌破碎物在进行14000r/min离心20min，取上清转移到另一干净离心管中；在上清中加入100U RNase A和50U DNase Ⅰ酶，37℃消化1h，将消化后的产物进行琼脂糖凝胶电泳检验，核实上清液中的内源性DNA和RNA的是否消化彻底；将消化彻底的上清液贮存于-20℃条件下，这些上清液就是制备的含有HCV和HIV-1RNA的假病毒溶液。