[发明专利]一种用高效液相色谱法检测发酵酒中尿素含量的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种发酵酒中尿素含量的检测方法，特别是涉及一种用连接荧光检测器的高效液相色谱技术检测检测发酵酒中尿素含量的方法。 

背景技术

在发酵饮料中，氨基甲酸乙酯（Ethyl carbamate，IARC group2A，简称EC）是一种潜在的具有遗传毒性和致癌性的风险物种，它是由精氨酸经过酵母菌细胞内精氨酸酶-尿酶（AU）路径分解产生的。国际上，联合国粮农组织（FAO）已于2002年将其纳入重点监控物种，不少国家出于对本国消费者健康和行业利益的考虑，分别制定了饮料酒中氨基甲酸乙酯的限量标准，这无疑加大了贸易摩擦的可能。与此同时，在我国发酵酒类饮料之中，啤酒、葡萄酒的EC含量通常较低，而黄酒由于制作过程中通常不采用蒸馏的方式，致使其中氨基甲酸乙酯的含量普遍较高。尿素是产生氨基甲酸乙酯的重要前驱物质，尿素和乙醇之间的反应是黄酒中氨基甲酸乙酯生成的主要途径。资料显示，尿素含量为18mg/L的加饭酒中潜在氨基甲酸乙酯含量可达1200μg/L。尿素已成为黄酒生产中涉及食品安全的重要监测指标之一。因此，为降低黄酒中氨基甲酸乙酯的水平，对尿素含量进行控制是一个关键和有效的措施。这不仅密切关系到人们的生命健康，也严重影响到中国酒类产品的出口。研究发酵酒中尿素准确、快速的测定方法，对氨基甲酸乙酯质量控制具有十分重要的意义。 

目前，检测尿素的常规方法主要为分光光度法、比色法、脲酶法等化学分析法，应用从原有的临床医学扩展到土壤、饲料、牛奶与饮料酒检测等领域。化学分析法灵敏度相对较低，黄酒中存在着与尿素结构和性质类似的氨基酸及铵离子等物质，对测定结果影响较大。二乙酰-肟分光光度法利用样品中的尿素与显色试剂在沸水浴中发色10-15min后比色测定，但比色测定误差随着尿素含量的增加而增大。同时测得结果中包含瓜氨酸，且酒中糖类和发色温度对结果影响较大；AOAC推荐的关于食品及其容器中尿素的标准检测方法，是通过测定尿素与9-羟基占吨反应生成的二黄质基脲溶于50%硫酸溶液所形成的黄色溶液的吸光度，进而确 定尿素的含量。但结果很容易受到未反应的9-羟基占吨的影响，同时该方法重现性较差，自动化程度不高；日本采用比色法利用流动注射分析（FIA）系统来定量酒类中尿素的含量，美国则基于同样原理研制出了酒类尿素比色法定量检测试剂盒。但此方法成本较高，不适合作为行业标准推广使用。英国的P.Herbert、Shona Clark等人还建立了利用高效液相色谱测定葡萄酒中尿素含量的方法。国内也有报道利用尿素在λ=203nm下紫外吸收的特征，采用高效液相色谱-紫外检测器(HPLC-UV)法测定黄酒中的尿素含量，但低波段检测对所用试剂级别要求较高，且易受干扰而造成基线不稳。 

综上所述，现有的尿素检测技术手段在发酵酒领域的应用都存在着某种程度的问题，为了保障中国发酵酒行业的健康发展，使其迅速接近并达到国际上关于酒类EC含量控制的要求，本发明提供一种准确，高效和低经济成本的发酵酒中尿素检测方法。 

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提出一种用常规的连接荧光检测器的高效液相色谱技术检测发酵酒中尿素含量的方法。 

本发明解决所述技术问题可以通过采用以下技术方案来实现： 

包括以下步骤： 

①称取适量样品，选择乙醇作为溶剂进行定容，稀释5倍，取稀释后的样品溶液置于带塞试管中； 

②加入盐酸溶液、9-羟基占吨溶液混匀，在室温避光的条件下进行衍生，时间为30min-50min； 

③利用旋转蒸发仪浓缩，形成浓缩溶液； 

④浓缩溶液用与乙醇进行定容，过0.45um有机滤膜，形成前处理后的待测溶液； 

⑤利用连接荧光检测器的高效液相色谱仪对待测溶液进行检测，有机流动相和无机流动相采用可变比例设定：0-16分钟有机流动相50%，无机流动相50%，16-30分钟有机流动相100%，无机流动相0%，流速设定为1.0mL/min，进样量设定为10uL，色谱柱选择C₁₈色谱柱，柱温40℃-50℃，荧光检测器的检测波长：λ_ex=208nm,λ_em=308nm。 

优选方案为： 

所述有机流动相为乙腈，无机流动相为水； 

衍生时加入的盐酸溶液浓度为1.5mol/L，9-羟基占吨溶液为0.03mol/L，样品溶液、盐酸溶液和9-羟基占吨溶液的比例为4:1:4； 

衍生时间为30min； 

柱温为45℃。 

本发明的技术效果在于：