[发明专利]一种脂肽定量检测的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种脂肽定量检测的方法，具体涉及一种利用荧光标记物检测脂肽的方法。

背景技术

脂肽是一种来源广泛，种类繁多，结构特殊的生物表面活性剂。脂肽拥有化学表面活性剂不可比拟的优良的表界面性质，而且对环境友好；脂肽生物活性广泛，它具有抗菌、抗肿瘤、抗凝血、溶细胞以及改变酶的活性等作用。因此，微生物脂肽在表面活性剂领域以及生物医药领域具有广泛的应用前景。

由于脂肽表界面活性高，一般用量较低，应用体系中脂肽的检测一直是一个难题。传统的重量法是在测试溶液中加盐酸使脂肽沉淀，沉淀物用有机溶剂反复萃取，蒸发掉有机溶剂、烘干后称重，定量脂肽，该检测方法的主要缺点是：体系需要加盐酸使脂肽沉淀，有机溶剂反复萃取，步骤繁琐，提取过程中易受到其他脂溶性物质的干扰，因而得不到脂肽的纯净物，只能粗略定量；薄层色谱法是将含脂肽样品采用薄层色谱分离，分离出的脂肽斑点进行水解，斑点水解后进行特异性染色，通过比较染色斑点的大小和颜色深度来定量脂肽，该检测方法的主要缺点是：薄层色谱分离后脂肽斑点需要采用浓盐酸高温密封水解，反应过程复杂，条件苛刻，同时，薄层色谱的分离效率低，定量误差大；高效液相色谱法是通过高效液相色谱对含脂肽的样品进行分离，利用紫外检测器检测，由保留时间确定脂肽峰，通过分析峰面积或峰高定量分析脂肽，该检测方法的主要缺点是：对现场复杂样品需要进行复杂的前处理，以免影响色谱柱的分离效果，同时检出限也较高(适用于脂肽含量约几百ppm的样品检测)，无法检测痕量脂肽。

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种检测方便快捷、反应条件温和、检测灵敏度高的脂肽定量检测的方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：一种脂肽定量检测的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)待检样品分离获得脂肽；2)脂肽与荧光标记物反应得到荧光标记的脂肽；3)荧光标记的脂肽利用高效液相色谱检测；4)由色谱峰面积计算脂肽含量。

步骤1)待检样品分离获得脂肽是在待检样品中加6M盐酸调节溶液pH＝2.0，然后乙醚萃取，萃取液除去乙醚获得脂肽。

步骤2)所述的荧光标记物为4-溴甲基-7-甲氧基香豆素。

所述的待检样品中脂肽浓度在0.1ppm～1ppm、1ppm～100ppm和100ppm～600ppm时，4-溴甲基-7-甲氧基香豆素的加入量分别为0.1mg、1mg和2mg。

所述的荧光标记物与脂肽反应在有机溶剂中进行，所述有机溶剂选自乙腈、丙酮或四氯化碳中的一种。

所述的有机溶剂为乙腈。

所述的荧光标记物与脂肽反应在催化剂下进行，催化剂选自Na₂CO₃、吡啶或三乙胺中的一种。

所述的催化剂为三乙胺，三乙胺加入量为100μL。

所述的荧光标记物与脂肽反应体系总体积采用所述的有机溶剂定容至1mL。

所述的荧光标记物与脂肽反应的温度为40℃～80℃，反应时间为10min～30min。

所述的荧光标记物与脂肽反应的温度为60℃，反应时间为20min。

本发明采用荧光标记脂肽，利用高效液相色谱分离及荧光检测器检测。现有技术采用高效液相色谱直接检测发酵液样品的脂肽(未荧光标记)，结果见图1(紫外检测(a)和荧光检测(b))，可见，由于样品中脂肽的含量太低，不能被紫外检测器和荧光检测器检测到，现有技术无法检测该样品。本发明技术针对同一发酵液样品，采用4-溴甲基-7-甲氧基香豆素荧光标记脂肽，标记后采用高效液相色谱检测，结果见图2(紫外检测(a)和荧光检测(b))，由图2可见，使用荧光标记后，带有荧光基团的脂肽采用荧光检测器检测，响应值很高；而采用紫外检测器检测，响应值很低，可见，本发明技术采用荧光标记脂肽后结合荧光检测能大大降低了脂肽检出限。同时，由于灵敏度大大提高，荧光的色谱图还可识别脂肽分子中脂肪链长度分别为13个碳、14个碳和15个碳的脂肽同系物(见图2)。

与现有技术相比，本发明采用荧光标记脂肽，利用高效液相色谱分离及荧光检测器检测的方法具有方法简便快捷，反应条件温和，检出限低的特点，检出限可以达到0.1ppm，大大提高了检测灵敏度。

附图说明

图1现有技术直接检测发酵液中脂肽的高效液相色谱图(紫外检测(a)和荧光检测(b))：

图2本发明技术采用4-溴甲基-7-甲氧基香豆素荧光标记发酵液中脂肽后检测的高效液相色谱图(紫外检测(a)和荧光检测(b))。