[发明专利]丁布诱导型玉米螟OfCYP启动子及活性分析

说明书

技术领域

本发明属生物工程技术领域，涉及一段DNA序列，它可以作为启动子调控基因的表达。具体涉及一种来源于玉米螟P450基因（GenebankNo.EU807990）并在细胞中高度表达的诱导型启动子序列。 

背景技术

玉米螟是一种重要的世界性农业害虫，通过米心叶期幼虫取食叶肉或蛀食未展开的心叶，造成“花叶”，抽穗后钻蛀茎秆，致雌穗发育受阻而减产，蛀孔处易倒折。穗期蛀食雌穗、嫩粒，造成籽粒缺损霉烂，品质下降。玉米在生长发育过程中产生许多次生物质，其中有些对害虫有明显的防御功能，影晌害虫的行为、生长发育和生殖。丁布为氧肟酸类中最重要的一种，在我国有人称之为玉米植抗素，它能抑制欧洲玉米螟幼虫的生长，增加幼虫死亡率，使得幼虫期和蛹期延长，导致蛹重下降，成虫繁殖力降低。丁布导致近似消化能力降低和摄取食物转化率降低。已有研究结果表明，丁布可以诱导玉米螟细胞色素P450基因OfCYP（gene bankNo.EU807990）高表达。这可能是玉米螟利用丁布作为化学感应信号来启动其防御机制进而应对丁布胁迫的重要生理机能。同时这也显示出玉米螟OfCYP基因启动子极可能具有较高诱导活性，迄今为止，未有从玉米螟中分离的诱导型高活性启动子。目前能应用于真核表达研究的丁布诱导型玉米螟启动子还未有。因此，对于新的高活性的丁布诱导型玉米螟相关启动子的克隆、顺式作用元件具体序列的确定、各元件之间的相互作用，以及与这些元件互作的转录因子的研究具有重要意义,对深入研究害虫植物次生物质耐受性机制及新型抗虫新品种的研制奠定基础。 

发明内容

本发明的一个目的是提供一种丁布诱导型玉米螟OfCYP启动子序列，该启动子序列能够诱导目的基因高水平表达，而且该启动子来源于玉米螟P450基因OfCYP。 

本发明的第二个目的是提供一种用于真核细胞转染的玉米螟OfCYP启动子真核表达载体，该载体指导高水平表达目的基因OfCYP的启动子序列和5'非翻译区。 

本发明的第三个目的是提供一种所述真核细胞表达载体的表达，该载体的表达能反映启动子活性的高低。 

为实现上述目的，本发明克隆了玉米螟P450基因OfCYP的启动子区，并构建了真核表达载体，所述载体包含带有OfCYP基因的5'非翻译区的上述启动子。随后利用所述载体在Sf9细胞中表达，并检测到该启动子的高水平活性。 

本发明提供一种获得的丁布诱导型玉米螟OfCYP启动子序列，所述启动子序列如SEQID NO:1所示，其中SEQIDNO：1的-1bp至-393bp区（见序列表）为丁布诱导型玉米螟OfCYP启动子DNA序列，在真核细胞中本发明所述的启动子高水平活性。 

获得的丁布诱导型OfCYP启动子序列源自玉米螟P450基因OfCYP。 

SEQIDNO:1的+1bp至+268bp区（见序列表）为玉米螟蚜P450基因OfCYP的5’非翻译区的DNA序列，本发明所述的玉米螟OfCYP基因的5'非翻译区能在Sf9细胞中通过增强目标外源基因的翻译效力，而诱导目标基因的高水平表达。 

为实现另一个目的，本发明提供一种用于细胞系转染的真核细胞表达载体，所述真核细胞表达载体包含丁布诱导型玉米螟OfCYP启动子序列。 

上述用于Sf9细胞转染的真核表达载体是指能够在细胞中瞬时、高水平表达外源基因的载体。例如pGL3载体、pGL4载体。 

一种用真核细胞表达载体的表达，所述真核细胞表达包含丁布诱导型玉米螟OfCYP启动子序列。 

关于本发明所述的用于真核细胞的表达载体（pGL3），所述的玉米螟OfCYP基因的启动子和5'非翻译区在表达载体中位于外源基因（Luc+）的前面。本发明提供通过插入本发明所述的玉米螟OfCYP基因的启动子和5'非翻译区至含有Luc+报告基因的载体中而构建的pGL3-OfCYP(-393/+268)。但是，所述Luc+报告基因是外源基因，并预期可以用任意其它有用的外源基因来代替。 

本发明提供来自玉米螟OfCYP基因的启动子和5'非翻译区，根据本发明的启动子和5'非翻译区使得能够在真核细胞中进行高水平的表达。 

本发明的有益效果在于：可用于真核基因的高效表达，应用于获得低丰度基因研究，使其获得高水平、稳定表达，对于目的功能研究具有积极意义。 

附图说明

图1为桃蚜基因组电泳图 

图2为GenomewalkerPCR电泳图 

图3为OfCYP连T载酶切鉴定电泳图