[发明专利]绵羊多核绒毛膜滋养层细胞的培养技术

说明书

技术领域

本发明涉及一种绵羊多核绒毛膜滋养层细胞的培养技术，属于细胞培养技术领域。

背景技术

本发明从取材及分离培养方法两方面对国内外培养绵羊绒毛膜滋养层细胞进行了改进。在取材方面，先前学者的取材部位是胎盘绒毛膜比较容易得到，而本发明在基于大量国内外文献的基础上发现，该细胞主要分布于胎盘子叶与肉阜的接触部位和子叶中，因而取材定位于此；在分离培养方面，先前学者要么是用组织块培养法要么是单一的酶消化法，而本发明则是通过胰蛋白酶和胶原酶两步消化分离培养绵羊多核绒毛膜滋养层细胞。

通过胰蛋白酶和胶原酶的配合使用，建立了可以分离培养绵羊多核绒毛膜滋养层细胞的两步消化法。胰蛋白酶能选择性地消化溶解变性蛋白质，对未变性的蛋白质无作用，因此，对活细胞的蛋白质以及有活性的消化酶不起作用。胰蛋白酶可以使细胞间的蛋白质水解从而将细胞离散。胶原酶仅对细胞间质有消化作用，而对上皮细胞影响不大。因此适于消化分离纤维性组织、上皮组织，可使上皮细胞与胶原成分分离而不受损害。该组织内含部分结缔组织或胶原成分，用胰蛋白酶单独解离细胞的实际效果较差，又因为绒毛膜滋养层细胞存在贴壁生长接触抑制的特点，所以可采用胰蛋白酶和胶原蛋白酶共同处理，使其细胞分散开来，利于其分裂生长。在此方法的指导下，获得了较高纯度的具有生物学活性的多核绵羊绒毛膜滋养层细胞。

绵羊绒毛膜滋养层细胞是构成胎盘屏障的主要组织结构，而胎盘是妊娠期间具有物质交换与代谢，分泌激素和防御等功能的重要器官。滋养层细胞在胚胎的植入过程中扮演重要角色，其增殖和功能调节异常与多种胎盘发育相关疾病的发生发展有着密切关系。绵羊胎盘绒毛膜滋养层细胞可分细胞滋养层细胞和合体滋养层细胞，多核滋养层细胞均存在于合体滋养层，而合体滋养层细胞位于母胎界面，大部分位于胎盘子叶中其功能主要是转运营养物质、进行气体交换、分泌多种激素，并保护胎儿免受母体免疫系统的损伤。因此多核滋养层细胞的培养是进行这些相关实验的基础，也将为推动妊娠滋养细胞疾病的诊断和治疗提供良好的实验基础。

组织和细胞离体后独立生存在人工的培养环境中，虽然模拟体内环境，仍有很大差异。因而利用培养细胞做实验时，不应视为体内细胞完全相同，把实验结果推测体内，轻易做出与体内等同的结论。

基于以上实验技术的缺点，本发明目的是寻求和建立一种可行的体外培养多核绵羊绒毛膜滋养层细胞的方法，可为体内实验做铺垫。

发明内容

本发明的目的是为了实现绵羊多核滋养层细胞的培养，提供的一种比较容易和使用体外培养方法。

为了实现上述目的，本发明的技术方案如下。

一种绵羊多核绒毛膜滋养层细胞的培养技术，具体包括以下步骤：

(1)进行多核滋养层细胞原代培养，具体过程为：

(1a)将新鲜的妊娠中期的绵羊胎盘用自来水冲洗一次，再用75％的酒精清洗3～5次，然后将其拿到经过消毒杀菌的操作间，而后取材。

(1b)使用高压过的手术器械，用手术剪将子宫壁剪开并将其打开，注意不要将羊膜与绒毛膜弄破。由于绵羊的胎盘属于子叶型胎盘且属于母包子型，所以绒毛膜滋养层所在部位为绒毛膜相嵌在肉阜内的部位，即为子叶。

(1c)使用另一套手术器械，将子叶小心地放在已经配好的含有高浓度双抗(PS)的PBS中，反复洗2～3次。

(1d)另外取5子叶用4％的多聚甲醛和2.5％的戊二醛固定，以备后面做石蜡切片和透射电镜标本。

(1f)倾去PBS，用高压好的眼科剪将子叶快速的剪成糊状，准备培养细胞。

(1g)用0.25％的胰蛋白酶37℃恒浴消化糊状组织30min，消化期间每隔5min振荡混匀一次，将上层不含组织的悬液转移至一个无菌的15ml离心管中。

(1h)用胶原酶IV37℃恒浴消化组织30min，消化期间每隔5min振荡混匀一次。

(li)两次消化下来的细胞经过100目细胞筛子过滤，滤液细胞1200rpm离心5min。

(1j)弃去上清液，将细胞用含20％胎牛血清的DMEM完全培养基吹打起来，在涡旋振荡器上振荡混匀，注意振荡不要太剧烈，以免破环细胞。

(1k)将细胞接种在25cm2的培养瓶中，每瓶加3ml完全培养基，放入CO₂孵化箱中，控制条件温度37℃，CO₂浓度5.0％。

(1l)每3d换一次完全培养液，当原代细胞贴壁为培养瓶壁的90％左右时(约需9d)，进行传代。

(2)进行多核滋养层细胞的传代培养，具体步骤为：