[发明专利]一种采用多次转化发酵法生产含有共轭亚油酸的脂肪酸甲酯的方法

说明书

【技术领域】

本发明属于微生物技术领域，更具体地，本发明涉及一种使用含金属离子培养基生产含有共轭亚油酸的脂肪酸甲酯的方法。

【背景技术】

共轭亚油酸（Conjugated linoleic acid,CLA）是具有共轭双键的十八碳二烯酸混合物的统称，是必须脂肪酸亚油酸（Linoleic acid，LA）的立体几何异构体，也可看作是亚油酸的次生衍生物。在过去的三十年中，CLA由于其多样的生理活性功能而受到广泛的关注，CLA具有的主要生理功能包括抗癌、抗动脉粥样硬化、抑制脂肪积累、促进生长、刺激免疫等。其中c9,t11-CLA、t10,c12-CLA和t9,t11-CLA是迄今为止确认具有生理活性的三种共轭亚油酸单体。

在自然界中，CLA存在于来源于反刍动物的肉制品和乳制品中，但是含量极低。目前，CLA的合成广泛采用化学异构法，即将红花油或葵花籽油通过碱催化异构法。但是通过此种方法获得的产物是多种异构体的混合物，其中包含许多生理功能及安全性未知的异构体，活性异构体难以分离纯化。所以，研究生物转化法获得成分单一的功能CLA具有重要的现实意义。

到目前为止，c9，t11-CLA生物合成的最高产量是Shimizu研究小组通过Delacroixia coronata菌株的delta-9脱饱和酶作用，以33.3mg/mL异油酸（trans-11-octadecenoic acid，t-OA）为底物转化生成10mg/mL的CLA，其中c9，t11-CLA纯度高达98%；由江南大学食品生物技术中心陈卫研究小组构建的重组耶氏解脂酵母菌株（CCFM-JU277-9），通过添加20g/L的大豆油，在5L发酵罐中发酵38.5h得到4g/L的CLA，其中t10，c12-CLA的纯度高达100%，是目前微生物发酵法合成t10，c12-CLA的最高产量。由于CCFM-JU277-9能够在胞内合成亚油酸异构酶（PAI），并催化LA形成专一的t10，c12-CLA单体形式。因此提高PAI蛋白总量将提高t10，c12-CLA的产量，CCFM-JU277-9合成t10，c12-CLA的产量仍具有提高空间。

所以本发明希望通过采用补料发酵方法以提高生物量继而提高PAI蛋白总量，并通过多次转化实验从而实现提高t10，c12-CLA产量及缩短微生物培养时间降低发酵成本的目标。

【发明内容】

[要解决的技术问题]

本发明的目的是提供一种采用多次转化发酵法生产含有共轭亚油酸的总脂肪酸的方法。

[技术方案]

本发明是通过下述技术方案实现的。

本发明涉及一种采用多次转化发酵法生产含有共轭亚油酸的总脂肪酸的方法。

所述生产含有共轭亚油酸的脂肪酸甲酯的方法的步骤如下：

A、平板活化培养

使用接菌环将重组耶氏解脂酵母菌株CCFM-JU277-9接种于装在平板中的固体培养基上，然后置于恒温培养箱中在温度20～32℃的条件下平板活化培养2～6天，得到斜面培养物；

B、种子培养

使用接菌环挑取在步骤A平板活化培养的培养物接种到液体种子培养基中，然后置于试管中，在温度20～32℃与150～250rpm的条件下培养40～52小时；

C、发酵培养

按照以发酵培养基体积计0.5%～2.0%接种量，将步骤B得到的种子培养物转接到液体发酵培养基中，置于发酵锥形瓶中在温度20～32℃与150～250rpm的条件下震荡培养使重组耶氏解脂酵母菌株CCFM-JU277-9进入第一个生长稳定期，继续培养至葡萄糖浓度下降至0.1g/L；接着往该发酵培养基中第一次补加葡萄糖，使该发酵培养液中葡萄糖浓度达到10g/L～20g/L，继续培养使重组耶氏解脂酵母菌株CCFM-JU277-9进入第二个生长稳定期，至葡萄糖达到0.1g/L；然后

往该发酵培养基中第二次补加葡萄糖，使该发酵培养液达到10g/L～20g/L葡萄糖，继续培养使重组耶氏解脂酵母菌株CCFM-JU277-9进入第三个生长稳定期，添加终浓度为20-70g/L的乳化红花籽油，继续培养35-60小时，得到一种发酵培养物，它在7500～8500rpm的条件下离心分离10～18分钟，得到一次转化的菌体与发酵上清液；