[发明专利]一种常染色体显性多囊肾病基因突变猪的生产方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及一种常染色体显性多囊肾病基因突变猪的生产方法及其应用。

背景技术

常染色体显性多囊肾病(ADPKD)是一种常见的遗传性多囊肾病，在人群中的发病率为1/400～1/1000。ADPKD以双侧肾脏出现充满液体的囊泡为主要特征，并伴随多种肾外症状，随着疾病的发展，肾实质逐渐被囊泡和纤维化组织替代导致肾脏功能丧失。患者的临床表现通常在20～30岁时出现，仅有不到2%的病例出现在胎儿或儿童时期。60岁时，大约50%的患者将会出现终末期肾脏病（ESRD），这占了所有ESRD病例的5%，这也是我国终末期肾病中的排名第四的致病因素。ADPKD是一种系统性疾病，除了肾脏表现异常外还可以影响全身其他器官，如：囊泡还可以发生在肝脏，胰腺，脾脏，甲状腺，蛛网膜和精囊腺，其中精囊腺的囊泡可能是导致ADPKD患者不育的一个主要原因。颅内动脉瘤是导致ADPKD患者死亡的另外一个原因，其发生率为5～7%，由于其往往发生在同一个家族成员中，因此认为其发生是家族性遗传导致。高血压是ADPKD患者最为常见的症状，它与囊泡的发展及肾脏体积的增大成正相关，大约60%的患者在肾衰竭前都会出现高血压。

目前人们已经发现ADPKD是由于PKD1和PKD2发生基因突变引起的，前者占据了所有ADPKD病例的85%，后者则占据了15%。研究发现PKD1突变能导致更严重的表型，例如更高的几率发生高血压和血尿，而且与ADPKD2患者通常在74岁左右发生ESRD相比，ADPKD1的患者要早20年左右到终末肾衰竭。PKD1突变导致更严重表型的原因并不是由于囊泡生长速度要快于PKD2突变，而是由于PKD1突变往往引起囊泡更早、更多地出现。

为了研究ADPKD的机理及筛选治疗药物，人们建立了大量小鼠模型。这些模型证明了PKD1与PKD2能调节细胞的增殖、凋亡、分化、极性及分泌过程，但是目前仍然没有对ADPKD很好的治疗方法通过小鼠模型的研究出现。猪作为一种与人类在生理学及解剖学上高度相似的生物，在生物医学研究中具有重要的价值。而且猪和人的肾脏在解剖功能上都要比其他动物更为接近，都表现为多肾叶和多肾乳头结构，肾上腺位于肾的头部，右侧肾上腺与后腔静脉壁相连，血流供应也是头部和尾部分开，而不是像多数物种那样纵向的血管分布。猪已经在发育和儿童泌尿学研究中作为模式生物，主要研究膀胱尿液回流和肾内回流。因此我们希望通过构建猪ADPKD疾病模型，给多囊肾病的治疗带来一些新的理论和方法。

构建基因敲除动物模型需要使用的方法有常规基因敲除和基因编辑技术，前者能够按照人们的目的定点改变基因序列。基因打靶技术最早是70年代在酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)中实现的，它的实现需要达到以下几个要求：能够在实验室中操作酵母DNA；能够将外源DNA片段引入酵母细胞中；供体DNA能够与宿主基因组发生同源重组；缺少与同源重组竞争的反应；能够利用筛选技术挑选出阳性产物。这些技术要求在当时其他真核生物中都难以实现，直到后来小鼠ES细胞的建立才为真核生物基因打靶筛选提供了良好的材料。同时在1988年，Mansour发明了正负筛选技术，大大提高了基因打靶阳性细胞的富集，由此人们利用基因打靶技术在小鼠和酵母菌中获得了大量知识。虽然基因打靶具有很多的优点，但是由于打靶效率低下(10^-6)和缺少胚胎干细胞，使得在其他物种中基因打靶技术的应用并不是十分广泛。随着分子生物学的发展，基因编辑技术的出现大大提高了基因敲除效率。基因编辑技术目前主要包括：ZFN、Talen和CRISPR-Cas9，他们通过特异地识别DNA序列，定点地引入DNA双链断裂，并利用宿主细胞中倾向错误的修复机制--非同源重组的末端连接引入突变造成目的基因失活。因此本发明中，我们利用基因编辑技术在猪成纤维细胞中高效实现PKD1基因突变，并通过体细胞核移植得到PKD1基因突变的小型猪模型。这些基因突变猪模型的建立，为常染色体显性多囊肾病的研究及药物筛选提供了很好的基础。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种常染色体显性多囊肾病基因突变猪模型的生产方法，建立的基因突变猪模型可用于常染色体显性多囊肾病的研究及药物筛选。

为了实现本发明目的，本发明首先提出一种常染色体显性多囊肾病基因突变猪的生产方法，包括下述步骤：