[发明专利]一种使用含金属离子培养基生产含有共轭亚油酸的脂肪酸甲酯的方法

权利要求书

1.一种使用含金属离子培养基生产含有共轭亚油酸的脂肪酸甲酯的方法，其特征在于该方法的步骤如下：

A、平板活化培养

使用接菌环将重组耶氏解脂酵母菌株CCFM-JU277-9接种于装在平板中的固体培养基上，然后置于恒温培养箱中在温度20～32℃的条件下平板活化培养2～6天，得到平板培养物；

B、种子培养

使用接菌环挑取在步骤A平板活化培养的培养物接种到液体种子培养基中，然后置于试管中，在温度20～32℃与150～250rpm的条件下培养40～52小时；

C、发酵培养

按照以发酵培养基体积计0.5%～2.0%接种量，将步骤B得到的种子培养物转接到pH4.5～8.5的液体发酵培养基中，置于发酵锥形瓶中在温度20℃-25℃与150～250rpm的条件下震荡培养35-40小时，当重组耶氏解脂酵母菌株CCFM-JU277-9进入生长稳定期，再添加终浓度为30g/L的乳化红花籽油与10mM二价金属离子溶液，该乳化红花籽油含有以所述红花籽油重量计0.1～1.0%乳化剂，接着在温度28-32℃与150～250rpm的条件下震荡培养48～100小时，得到一种发酵培养物，它在7500～8500rpm的条件下离心分离10～18分钟，得到菌体与发酵上清液；

所述的菌体使用以重量计0.70～1.00%NaCl水溶液洗涤2～3次，得到的洗涤液与所述的发酵上清液合并，合并的发酵上清液用于后续处理；洗涤的菌体接着进行冻干；

D、由菌体提取脂肪

按照以mg计冻干菌体与以ml计8～12%盐酸-甲醇溶液之比为20～50：0.5～1.5，让步骤C所得到的冻干菌体与8～12%盐酸-甲醇溶液在温度45～-65℃的条件下进行甲酯化2.5～3.5小时，然后加入与盐酸-甲醇溶液等体积的正己烷提取5～15分钟，接着在5000～7000rpm的条件下离心分离2～5分钟，在分离上清液后所得到的残余物再重复上述提取操作1～2次，分离上清液合并，用氮气吹干，得到所述的含有共轭亚油酸的脂肪酸甲酯；

E、由发酵上清液提取脂肪

按照以ml计发酵上清液与氯仿甲醇混合液之比为1:8.0～12.0，用按照体积比1:1混合的氯仿甲醇混合液提取合并发酵上清液2～4次，提取液合并，用氮气吹干，再加入与氯仿甲醇混合液等体积的8～12%盐酸-甲醇溶液在温度45～65℃的条件下进行甲酯化0.5～3小时，然后加入与盐酸-甲醇溶液等体积的正己烷提取5～15分钟，接着在3000～7000rpm的条件下离心分离2～5分钟，在分离上清液后所得到的残余物再重复上述提取操作1～2次，分离上清液合并，用氮气吹干，得到所述的含有共轭亚油酸的脂肪酸甲酯。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的平板固体培养基制备方法如下：

按照20g/L葡萄糖、1.7g/L无硫酸铵无氨基酸酵母氮源、5g/L硫酸铵和20g/L琼脂粉，将葡萄糖、无硫酸铵无氨基酸酵母氮源与硫酸铵溶解于蒸馏水中，再使用无机酸或无机碱水溶液将所得到溶液的pH调节至5.5，再加入琼脂粉，然后在温度115℃的条件下灭菌20min。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的种子培养基制备方法如下：

按照20g/L葡萄糖、1.7g/L无硫酸铵无氨基酸酵母氮源与5g/L硫酸铵，将葡萄糖、无硫酸铵无氨基酸酵母氮源与硫酸铵溶解于蒸馏水中，再使用无机酸或无机碱水溶液将所得到溶液的pH调节至5.5，然后在温度115℃的条件下灭菌20min。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的发酵培养基制备方法如下：

按照20g/L葡萄糖、10g/L酵母粉与20g/L蛋白胨，将葡萄糖、酵母粉与蛋白胨溶解于蒸馏水中，再使用无机酸或无机碱水溶液将所得到溶液的pH调节至4.5-5.5，然后在温度115℃的条件下灭菌20min。

5.根据权利要求2-4中任一项权利要求所述的方法，其特征在于所述的无机酸选自硫酸或盐酸；所述的无机碱选自氢氧化钠或氢氧化钾；所述无机酸或无机碱水溶液的浓度是2.0～4.0mol/L。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的红花籽油乳化液制备方法如下：

把红花籽油添加到以重量计0.6%乳化剂水溶液中，直到红花籽油的浓度达到150～250g/L，接着使用超声设备在功率200W的条件下进行超声处理4～6分钟，再使用0.22μm无菌滤膜过滤除菌。