[发明专利]一种基于Caco-2细胞模型的抗氧化剂抗氧化活性定量评价方法

说明书

技术领域

本发明涉及抗氧化剂，尤其是涉及一种基于Caco-2细胞模型的抗氧化剂抗氧化活性定量评价方法。

背景技术

流行病学和临床实验研究已证明，人体自由基过剩是引发心血管病、癌症和衰老等慢性退行性疾病的重要因素，而饮食摄入和补充抗氧化剂是预防这些疾病的有效途径。因此，对抗氧化剂的抗氧化活性进行评价一直是营养保健食品研究的热门领域。迄今抗氧化剂活性评价方法主要包括体外化学分析法、动物实验法和人体试食试验法三大类。体外化学方法操作简单、快速、分析成本低，但测定结果不能真实反映抗氧化剂在体内的抗氧化能力，因为体外化学法是在试管化学分析的基础上建立的，没有考虑到抗氧化剂在体内的消化、吸收和代谢特性。动物实验法或人体试食法可真实反映抗氧化剂在体内的实际抗氧化能力，但是这些方法评价时间长，耗药量大，评价成本高，不适用于抗氧化剂筛选研究的初始阶段。因此，建立一种简单、快速和高生物相关性的抗氧化活性体外定量评价方法是抗氧化研究领域亟待突破的关键科学问题。

2007年康奈尔大学Wolfe and Liu（Wolfe,K.L.;Liu,R.H.Cellular antioxidant activity(CAA)assay for assessing antioxidants,foods,and dietary supplements.J.Agric.Food Chem.2007,55(22),8896-8907）建立了一种基于人肝癌细胞HepG2模型的细胞学抗氧化活性（CAA）定量分析方法，用来检测抗氧化剂的抗氧化活性。该方法的问题在于所选用细胞模型不能反映抗氧化剂在肠道的吸收特性，且迄今未见该方法的生物相关性研究报道。因此，测定结果是否能预测抗氧化剂在体内的实际功效仍然存在很大的疑问。2008年加拿大NIS实验室Jensen（Jensen,G.S.Cell-based antioxidant protection assay.U.S.Provisional patent application.60/985,166）建立了基于人血液红细胞模型的抗氧化活性评价方法，由于每次测定前都要收集和制备人血红细胞，操作过程复杂，限制了其实用价值。2009年魁北克大学Girard-Lalancette等（Karl Girard-Lalancette;AndréPichette;Jean Legault.Sensitive cell-based assay using DCFH oxidation for the determination of pro-and antioxidant properties of compounds and mixtures:Analysis of fruit and vegetable juices.Food Chem.2009,115,720–726）建立了基于小鼠成纤维母细胞瘤（L929）细胞模型的抗氧化分析方法，将测定点设置在自由基作用于细胞90分钟这一时间点，因而方法重复性差，误差较大。

大量研究证明，来源于人结肠腺癌Caco-2细胞株，其细胞形态学、标志酶、体外培养条件下形成的微绒毛结构以及紧密连接和渗透特征等均与小肠上皮细胞类似，利用该细胞的单层模型进行药物体外吸收特性研究与药物口服在小肠中的吸收过程有良好的相关性，因此Caco-2细胞模型被认为是一种预测药物吸收的有效体外工具。目前已被广泛用于药物和营养物质体外吸收、代谢特性研究。目前国内外还未见有关利用该细胞模型建立一种抗氧化活性体外定量分析方法的研究报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于Caco-2细胞模型的抗氧化剂抗氧化活性定量评价方法。

本发明包括以下具体步骤：

1）将100～200L的Caco-2单细胞悬浮液按1×10⁴～1×10⁵个细胞/孔的浓度接种至透明平底黑色96微孔细胞培养板中培养；

2）将步骤1）的96微孔板中生长培养基移出，用100～200L1×PBS清洗贴壁细胞；

3）用含有20～100M DCFH-DA的抗氧化剂处理培养基配制6个不同浓度的抗氧化剂溶液；

4）将步骤3）得到的抗氧化剂溶液100～200L加入步骤1）的96微孔板中，记为样品孔，孵育，对照孔和空白孔为只含有20～100M DCFH-DA的抗氧化剂处理培养基处理的细胞孔，每个样品、对照和空白各3个重复孔；

5）将步骤4）的96微孔板中溶液移出，用100～200L1×PBS清洗贴壁细胞；