[发明专利]一种蜡样芽孢杆菌多克隆抗体的制备方法

权利要求书

1.一种蜡样芽孢杆菌多克隆抗体的制备，其特征在于，包括以下步骤： 

(1)富集：首先将蜡样芽孢杆菌的菌种活化，利用培养基将活化的蜡样芽孢杆菌菌种富集到一定的数量，洗涤制备菌液，高速离心，弃上清，得到菌富集沉淀，并用生理盐水洗涤沉淀； 

(2)固定：使用改良型沸水浴加热方法，使得蜡样芽胞杆菌的表面成分固定，抗原决定簇充分暴露，制备得到菌抗原； 

(3)乳化：将固定好的蜡样芽孢杆菌的生理盐水悬浮液调至合适菌浓度，分别添加一定剂量的佐剂1及佐剂2，利用自组装乳化仪处理分层混合物得到均匀的乳化液； 

(4)免疫：将制备得到的乳化液，以背部多位点为主，以腹股沟、腋窝、脚蹼的外周位点为辅的肌肉注射方式，及短免疫间隔方式，注射到新西兰大白兔体内； 

(5)抗血清效价：采用ELISA方法评估抗血清效价，符合标准后，对大白兔进行加强免疫，准备取全血； 

(6)取全血：采用水合氯醛对大白兔进行麻醉，从颈部动脉取全血； 

(7)抗血清制备：将兔全血在合适的温度静置，使抗血清自然层析，然后采用高速离心的方法将抗血清从全血中分离出来； 

(8)纯化：利用正辛酸饱和硫酸铵法，从兔血清中制备得到抗蜡样芽孢杆菌的多克隆抗体。 

2.根据权利要求1所述的一种蜡样芽孢杆菌多克隆抗体的制备，其特征在于：步骤（1）中，所述的菌种活化方法是将0.5～1mL的-80℃冻存的蜡样芽孢杆菌的菌种加入到20～40mL Luria～Bertani液体培养基中，36～38℃恒温摇床150～250rpm震荡过夜。富集活化菌种的培养基是Luria～Bertani固体培养基，富集方法是取50～150ul活化好的菌种用涂布法将其均匀涂布在Luria～Bertani固体培养基表面，36～38℃恒温培养箱，培养12～24h。 

3.根据权利要求1所述的一种蜡样芽孢杆菌多克隆抗体的制备方法，其特征在于：步骤（1）中，一定数量是指当培养的蜡样芽孢杆菌的菌体数量可以完全覆盖平板时，且菌层厚度为2～3mm；洗涤用液是2～3mL浓度为0.9%的生理盐水，洗涤方式是用无菌的涂布棒进行刮板，操作要轻，避免将培养基刮下，收集洗涤液。 

4.根据权利要求1所述的一种蜡样芽孢杆菌多克隆抗体的制备方法，其特征在于：步骤（1）中，高速离心操作是指7000～9000rpm/min，离心5～10min，洗涤沉淀的方式是将菌沉淀轻轻弹起洗涤，洗涤次数为3～5次，洗涤液是浓度为0.9%的生理盐水。 

5.根据权利要求1所述的一种蜡样芽孢杆菌多克隆抗体的制备方法，其特征在于：步骤（2）中，改良型沸水浴加热方法是指将菌沉淀首先浸润于液氮5～10min，然后快速完全溶解于5mL-10mL浓度为0.9%的生理盐水中，置于沸水浴边加热边震荡15～20min。 

6.根据权利要求1所述的一种蜡样芽孢杆菌多克隆抗体的制备方法，其特征在于：步骤（3）中，佐剂1是氟氏佐剂，佐剂2是RIBI佐剂，氟氏完全佐剂是用于背部皮下多位点免疫，RIBI佐剂是用于腹股沟、腋窝、脚蹼外周位点免疫注射；两种佐剂的用量均为0.5～2mL，背部多位点免疫注射菌抗原悬浮液的浓度为5×10⁸～10×10⁸cfu/mL，用量为0.5～2mL；腹股沟、腋窝、脚蹼外周位点免疫注射菌抗原悬浮液的浓度为1×10⁸～5×10⁸cfu/mL，用量为0.5～2mL。 

7.根据权利要求1所述的一种蜡样芽孢杆菌多克隆抗体的制备方法，其特征在于：步骤（3）中，短免疫间隔是指首次免疫与第二次免疫、第三次免疫、第四次免疫注射间隔时间为5～9d，2～4d，2～4d，2～4d。自组装乳化仪包括迷你电机其可承受转速为8000～12000rpm，迷你变压器其可将220V电压转换为10～1.0V的小电压、自制转子具有反向齿轮、自制乳化管可以装载2～7mL混合物体积；乳化时间为30～50min。 

8.根据权利要求1所述的一种蜡样芽孢杆菌多克隆抗体的制备方法，其特征在于：步骤（4）中，新西兰大白兔为1～2月龄，重约2～3Kg的雌性大白兔，多位点为背部平行的八个位点，每个位点注射200～300ul。