[发明专利]人源化抗炭疽保护性抗原PA的抗体及应用

说明书

技术领域

本发明涉及抗炭疽单抗的基因、基因编码的多肽、鼠源单抗及人鼠嵌合抗体制备技术，以及所述基因和多肽在制备炭疽治疗、预防性药物中的应用。

背景技术

炭疽病是一种由炭疽芽孢杆菌引起的人畜共患的急性烈性传染病，主要通过皮肤、消化道、呼吸道感染动物和人，在世界范围内广泛分布。炭疽芽孢杆菌在血液中可产生并释放三种蛋白：保护性抗原（protective antigen，PA）、致死因子（lethal factor，LF）、水肿因子（edema factor，EF）。实验证实，炭疽毒素是一种AB（active-binding）的模式。PA即PA83是复合物中的“B”，与细胞膜上的炭疽毒素受体（2型毛细血管形成蛋白CMG2或肿瘤肉皮细胞标志8TEM8）结合，由位于细胞膜上的Furin蛋白酶切除其氨基端20kD片段PA20，余下的63kD片段（PA63）发生寡聚化，在膜上形成七聚体（（PA63）₇）。LF和EF是“A”，能够结合七聚体形成的复合物通过受体介导的内吞进入细胞。在内吞小体酸性pH的环境下，PA七聚体发生构象改变，形成一个管道，使EF和LF进入细胞液，分别发挥毒性作用。这三种蛋白本身是无毒的，但PA和LF的混合物称为致死毒素，PA和EF的混合物称为水肿毒素。在体外实验研究中，单纯使用高纯度的致死毒素或水肿毒素可以使动物死亡。通过阻断PA与受体结合或是与LF及EF，以及影响其寡聚化，都可以有效防止炭疽毒素的致病作用。而且PA能诱导机体的保护性免疫，是目前唯一获美国食品药品监督管理局批准的人用炭疽吸附疫苗（anthrax vaccine absorbed，AVA）的主要活性成分。因此，保护性抗原是炭疽病治疗的理想靶点。

炭疽的医学防护措施主要有预防和治疗二大方面。目前有效的预防措施主要是接种炭疽疫苗，接触前1～2个月进行预防接种，能为人群提供免疫防护。有效的治疗措施主要有二大类：一类是炭疽杆菌的抑菌剂和杀菌剂，其中包括抗菌素和噬菌体的溶菌成分；另一类是根据炭疽病理模型设计的毒素抑制剂，主要包括炭疽毒素的中和抗体、可溶性受体、毒素突变体和小分子拮抗剂。

炭疽感染的治疗包括高剂量静脉注射和口服抗生素，例如青霉素、环丙沙星、四环霉素、

红霉素、和万古霉素。而以抗生素治疗必须及时，且对于已释放的毒素是没有效果的，而且目前已发现具抗药性的菌株。

国内外的研究表明，在暴露于炭疽芽孢之前使用抗PA抗体，能够起到预防炭疽感染保护机体的作用。而且，在攻毒后一定时间给药（24～48h）仍能起到保护作用，即使是在出现体征后给药也可以起到一定的治疗作用。

现已有多家公司或研究所机构进行炭疽抗体的研究，国外已有多家公司正在进行临床前研究。但是中国专利中关于炭疽抗体的研究显示抗体的结合力或是动物保护效果还有很大的提升空间。

发明内容

解决的技术问题：本发明提供一种人源化抗炭疽保护性抗原PA的抗体及应用，通过单克隆抗体技术筛选到了对炭疽保护性抗原PA具有高度亲和力的单克隆抗体，并获取了赋予所述抗体异特性的重链和轻链可变区的氨基酸序列和核苷酸序列，并对所述抗体的重链和轻链恒定区进行了人源化改造，最终获得了具有特异的抗原结合性、优异的毒素中和活性以及良好的动物保护功能。

技术方案：抗炭疽保护性抗原（Protective Antigen，PA）的杂交瘤细胞株PA6。

抗PA单克隆抗体PA6，由上述杂交瘤细胞株PA6产生。

一种含有上述抗体重、轻链可变区的抗PA的人鼠嵌合单克隆抗体，所述单克隆抗体的重链可变区具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列，轻链可变区具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列。

所述单克隆抗体的重链恒定区具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列，轻链恒定区具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列。

所述重链可变区具有SEQ ID NO:1的DNA序列，轻链可变区具有SEQ ID NO:3的DNA序列。

所述重链恒定区具有SEQ ID NO:5的DNA序列，轻链恒定区具有SEQ ID NO:7的DNA序列。

一种含有编码单克隆抗体重链或轻链的核苷酸编码的表达载体，重链可变区具有SEQ ID NO:1的DNA序列，轻链可变区具有SEQ ID NO:3的DNA序列，重链恒定区具有SEQ ID NO:5的DNA序列，轻链恒定区具有SEQ ID NO:7的DNA序列。

所述载体为抗体IgG1亚型分泌型真核表达载体。