[发明专利]牦牛肉嫩度候选基因检测试剂盒及其检测方法

权利要求书

1.一种牦牛肉嫩度候选基因的PCR-SSCP检测引物，其特征在于包括有：

引物序列为：

CAPN3-F:5'CAGAGTCTCCAGGACACTCACACA3'；

CAPN3-R:5'CCTTAGAAGGCAGCTCTGAAATTGTG3'。

2.一种牦牛肉嫩度候选基因的PCR-SSCP检测试剂盒，其特征在于包括有PCR反应液，CAPN3*B或CAPN3*C的DNA标准样；，去离子水，10%过硫酸铵，上样变性缓冲液，TEMED，12%的非变性聚丙烯酰胺凝胶Arc:Bis=37.5:1；

所述的上样变性缓冲液，包括98%去离子甲酰胺，0.025%溴酚蓝，0.025%二甲苯青，10mmol/L EDTA pH8.0；

所述的PCR反应液：总体积20μL，其中10×buffer缓冲液为2.0μL，Mg²⁺浓度为2.5mM，dNTPs的终浓度为100μM，引物CAPN3-F:5'CAGAGTCTCCAGGACACTCACACA3'和CAPN3-R:5'CCTTAGAAGGCAGCTCTGAAATTGTG3'各0.1μM，Taq聚合酶0.5U，ddH₂O补充体积至20μL。

3.如权利要求2所述的牦牛肉嫩度候选基因PCR-SSCP检测试剂盒的使用方法，其特征在于步骤为：

（1）待检牦牛基因组DNA1μL/50ng与试剂盒中PCR扩增液混合，反应条件：预变性94℃5min，变性94℃30s，退火62℃30s，延伸72℃30s，共35个循环，最后延伸72℃10min进行扩增；

（2）用步骤（1）中扩增的PCR产物和CAPN3*B或CAPN3*C的DNA标准样与试剂盒中SSCP检测试剂各组分混合进行SSCP检测；

（3）步骤（2）中检测到的带型与CAPN3*B或CAPN3*C标准样带型一致的样品为携带控制牦牛肉嫩度等位基因的个体。

4.一种牦牛肉嫩度候选基因PCR-SSCP检测方法，其特征在于检测步骤为：

（1）样品采集：牦牛颈静脉采血10ml,ACD抗凝，-20℃冻存；

（2）基因组DNA的提取：用常规的酚-氯仿抽提法从冻存血样中提取基因组DNA；

（3）聚合酶链式反应：

PCR反应体系：总体积20μL，其中10×buffer缓冲液为2.0μL，Mg²⁺浓度为2.5mM，dNTPs的终浓度为100μM，引物CAPN3-F和CAPN3-R各0.1μM，Taq聚合酶0.5U，模板DNA50ng，ddH₂O补充体积至20μL；反应条件：预变性94℃5min，变性94℃30s，退火62℃30s，延伸72℃30s，共35个循环，最后延伸72℃10min；

引物序列为：

CAPN3-F:5'CAGAGTCTCCAGGACACTCACACA3'；

CAPN3-R:5'CCTTAGAAGGCAGCTCTGAAATTGTG3'。

（4）PCR产物的SSCP检测：

取2μl的PCR产物加入8μl的上样变性缓冲液，包括98%去离子甲酰胺、0.025%溴酚蓝、0.025%二甲苯青、10mmol/L EDTA pH8.0，98℃变性10min，立即冰浴10min；12%的非变性聚丙烯酰胺凝胶，250V电压条件下，10℃电泳18h，银染法显色后拍照；

（5）结果判断：

对牦牛CAPN3基因第2内含子的PCR-SSCP检测，有3个等位基因，控制牦牛肉嫩度的等位基因为CAPN3*B的核苷酸和CAPN3*C核苷酸序列；对牦牛肉嫩度无影响的为CAPN3*A核苷酸序列。