[发明专利]一种来源于猪睾丸类胚胎干细胞的分离方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种来源于猪睾丸类胚胎干细胞的分离方法，属于干细胞生物工程。

背景技术

睾丸干细胞又可称为来源于睾丸组织的类胚胎干细胞或多功能干细胞。2004年，Mito Kanatsu-Shinohara等从新生小鼠睾丸消化成分散的细胞，然后在明胶包被的培养皿中培养，第二天将没有贴壁的细胞收集后，接种到小鼠成纤维细胞饲养层上，基础培养液为DMEM，添加15%FCS（胎牛血清）、2-巯基乙醇、bFGF（碱性成纤维细胞生长因子），经过多代培养，形成了多功能干细胞克隆。2009年，Nady Golestaneh将人睾丸内的生殖细胞分离出来，在明胶包被的培养皿中培养，其培养基为DMEM，添加15%血清替代品、L-谷氨酰胺、非必须氨基酸、β-巯基乙醇、bFGF，培养后得到了类胚胎干细胞。2010年，S.C.Mizrak将人的睾丸组织消化成分散的细胞，在StemPro培养液中培养，得到了类胚胎干细胞。2012年，J.V.Chikhovskaya将人的睾丸细胞消化成分散的细胞，接种到小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上，添加人胚胎干细胞培养基(KO-DMEM)，添加15%FCS、bFGF等，得到类胚胎干细胞。现有的技术方案的应用对象是人或小鼠，对猪的研究很少。

发明内容

本发明的目的在于提供一种来源于猪睾丸类胚胎干细胞的分离方法。

本发明的目的通过如下技术方案实现：

一种来源于猪睾丸类胚胎干细胞的分离方法，包括配制培养液、配制消化酶、猪睾丸类胚胎干细胞的分离三个步骤，其中：所述配制的培养液由α-MEM、血清替代品、青霉素、链霉素组成。

优选的是：培养液中血清替代品加入量为10%α-MEM体积，每毫升α-MEM加入100U青霉素、100μg链霉素。

优选的是：猪睾丸类胚胎干细胞在此培养液的培养条件：32.5-37℃，通入含有5%体积分数CO₂的空气条件下培养10-15天，3天换一次等量的培养液。

所述的配制消化酶包括消化酶I、消化酶II、消化酶III配制，具体方法为，

消化酶I：胶原酶按2mg/ml、DNaseI按50μg/ml溶于DMEM/F12中；

消化酶II：胶原酶按2mg/ml、透明质酸酶按2mg/ml、DNaseI按50μg/ml溶于DMEM/F12中；

消化酶III：胰酶按0.25mg/ml、DNaseI按50μg/ml溶于DMEM/F12中。

所述的猪睾丸类胚胎干细胞的分离具体方法为：

1、从农场选1月龄一下的猪，取出睾丸，放入PBS中，带回实验室。

2、将睾丸放入体积分数为75%酒精中浸泡10min。

3、去掉睾丸白膜，继续在体积分数为75%酒精中浸泡10min。

4、切开睾丸，取睾丸组织2g，剪碎。

5、消化，加8-10ml消化酶I，37℃水浴、90转/min摇床消化40-60min，380g条件下离心5min；

6、弃消化酶I；加8-10ml消化酶II，37℃水浴、90转/min摇床消化20-30min，380g条件下离心5min；

7、弃消化酶II；加8-10ml消化酶III，37℃水浴、90转/min摇床消化10-15min。

8、加1ml血清终止消化。

9、用孔径为40μm的细胞过滤筛过滤。

10、用36ml培养液稀释细胞，然后将细胞接种到12孔培养板中，每孔细胞为3×10⁵个细胞，加入1ml培养液。

11、在32.5-37℃，通入含有5%体积分数CO₂的空气条件下培养10-15天，3天换一次等量的培养液。

本发明使用的培养液成分简单，克隆形成效果好，解决了猪睾丸类胚胎干细胞的分离的问题。

附图说明

图1为培养10天睾丸类胚胎干细胞克隆的形态，图2为培养15天睾丸类胚胎干细胞克隆的形态。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，但本发明的实施方式并不局限于实施例表示的范围。这些实施例仅用于说明本发明，而非用于限制本发明的范围。此外，在阅读本发明的内容后，本领域的技术人员可以对本发明作各种修改，这些等价变化同样落于本发明所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

（一）溶液的配制