[发明专利]一种三维灌流式细胞培养器及其应用

说明书

技术领域

本发明属于细胞培养设备或装置领域，具体涉及一种三维灌流式细胞培养器，同时还涉及一种三维灌流式细胞培养器的用途，在三维灌流培养条件下，使新生肾皮质部位的胚胎干细胞/祖先细胞成功分化为肾小管组织的一种细胞培养器。

背景技术

自Willhelm Roux于1885年从鸡胚中分离细胞首次建立体外细胞培养，单层细胞培养技术已有百余年的历史。一个多世纪以来，单层细胞培养有了蓬勃的发展。特别是在制药或者疫苗合成等产业化领域，通过细胞的快速分裂，高效率地制造产品。但在生命科学基础研究领域，对于细胞的体外培养，关注的不仅仅是它们的分裂生长，更为重要的是它们经过传代后能否维持体内的性状。在很多情况下，单层细胞培养技术所取得的研究结果和体内的情况不符合，因为细胞在体外改变的环境下增生，逐渐丧失了原有的性状。动物实验完全在体内进行，但由于体内的多种因素制约以及体内和外界环境相互影响而变得复杂化，难以研究单一过程。另外，我们在动物身上所观察到的结果，往往是最终呈现的表现型，而非研究者最为关心的中间过程。显然，如何填补单层细胞培养和动物实验的鸿沟，一直是生命科学家思索的问题。尤其是在再生医学领域，迫切需要建立一套细胞培养技术，既能生长传代，还能最大程度地维持体内性状，并使干细胞分化产生新的组织结构，以便替代体内因疾病损坏的组织。随着组织工程的新兴发展，三维细胞培养技术应运而生。

体外细胞培养的一个重要原则是需模拟体内细胞生长环境，该模拟系统中最重要的核心因素是细胞与培养环境之间的相互作用。不同于传统的单层细胞培养，三维细胞培养技术是指将具有三维结构不同材料的载体与各种不同种类的细胞在体外共同培养，使细胞能够在载体的三维立体空间结构中迁移、生长，构成三维的细胞-载体复合物。三维细胞培养中，细胞外基质蛋白充当生长支架，使得细胞能够分化产生一定的三维组织结构，所创建的细胞生长环境，需要最大程度地模拟体内环境。近几年三维细胞培养技术在组织形成、血管发育和器官再造等领域得到了广泛的应用；同时在筛选新药的疗效分析和毒理实验方面，利用三维培养获得了和二维单层培养完全不同的结果，引起了药物学家的极大兴趣。

在常规的三维细胞培养中，一般采用静态培养的方法。仔细观察静态培养中的微环境，不难发现培养液的总体积数倍大于与所培植细胞真正接触的培养液体积，这一过大的“死角体积”阻碍了细胞的分化。在静态环境中，细胞产生的代谢废物积累在培养腔室中，对分化有害。引入动态的灌流培养，保证持续新鲜的化学培养液以恒定的速率进入培养器内部，提供细胞分化所必须的营养和诱导因子，并及时移去代谢废物。离开灌注培养器的培养液不再循环使用，而是通过乳胶导管被导入废液瓶。这为分化奠定了前提。

运用脉管取代支架材料，填充在培养器内的凹槽腔中。实验证实，和支架材料相比较，外观海绵状的脉管能更明显地降低培养的“死角体积”。化学合成的脉管由约5μm截断直径的中空管状纤维组成，管状纤维的侧面分布有大量nm级的孔洞。脉管铺设在凹槽腔中后，细胞营养液先经过进流腔流入脉管的中空管内，再从侧面孔洞中渗漏出来才接触到细胞，从而真实模拟体内毛细血管供血的生理状况，使体外再生组织成为可能。

即使按照以上工艺步骤，引入了灌流式营养液运输及在细胞器中填充脉管降低死角体积，如果所选用的脉管材料不合适，仍不能使干细胞分化成组织。脉管是一种具有网孔结构的高分子合成材料，它应该具备充分的可变形性，足够的亲水性表面以及最佳的生物适配性。在寻找适于作为脉管的材料方面，不能考虑刚性物质。通过对胶原纤维和羊毛等大量海绵类物质进行实验筛选，我们最终发现，聚酯纤维是适合制造脉管的最佳材料。

干细胞是具有多向分化潜能的原始细胞，是机体的起源细胞，是形成人体各种组织器官的原始细胞。在加入特定诱导因子的条件下，它可以分化成多种功能细胞或组织器官，医学界称其为“万用细胞”。目前，干细胞治疗方兴未艾，即把健康的干细胞移植到病人体内，以达到修复病变细胞或重建功能正常的组织的目的。近年来，成人干细胞移植在挽救白血病、淋巴癌和其它血液病人生命方面发挥了重要作用。但是，直接将干细胞植入人体内，存在着发展成肿瘤的风险。毫无疑问，将干细胞在体外预先定向分化成所需的组织，再移植到体内，代表了未来临床治疗的方向。

透析和器官移植是目前临床上处理肾衰竭的二种常用治疗方案。然而，高昂的医疗费用，短暂的透析寿命（一般仅能维持几年）和匮乏的供体器官是造成急慢性肾衰竭死亡率高的成因。运用本发明三维灌流式细胞培养器，我们在世界上首次使新生肾皮质部位的胚胎干细胞/祖先细胞成功分化为肾小管，为治疗肾小管坏死造成的急慢性肾炎带来新的希望。

发明内容