[发明专利]一种人源产肠毒素大肠杆菌粘附素EtpA融合蛋白及其应用

说明书

本发明公开了一种人源肠毒素大肠杆菌粘附素EtpA融合蛋白及其应用，本发明提供了一种含有人源肠毒素大肠杆菌的粘附素基因的重组质粒pGEX‑etpA，将该重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)，诱导重组表达菌BL21(DE3)/pGEX‑etpA表达融合蛋白EtpA。利用表达的重组蛋白主动免疫初产蛋鸡，制备了针对这种蛋白的卵黄抗体，提取的卵黄抗体验证了重组蛋白具有良好的抗原性，并利用小鼠肠道攻毒试验及体外实验，证明提纯的卵黄抗体能够抑制ETEC菌株在小鼠肠道内及体外对上皮细胞的粘附。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种人源产肠毒素大肠杆菌粘附素EtpA融合蛋白及其应用，通过构建人源产肠毒素大肠杆菌的粘附素基因etpA重组质粒pGEX-etpA，将其转入大肠杆菌表达融合蛋白，免疫蛋鸡，提纯的卵黄抗体能够抑制ETEC菌株在小鼠肠道内及体外对上皮细胞的粘附。

背景技术

产肠毒素大肠杆菌（Enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC）是引起腹泻的主要致病菌（Black1990;Ericsson2003）。据统计每年ETEC可在5岁以下儿童中引起2.8-4亿次腹泻，病情轻重不等，可以仅有轻微腹泻，也可呈重症霍乱样，导致每年约30-50万婴幼儿死亡（WHO2004）。它还与诸多患儿的营养不良以及发育迟缓相关（Qadri et al2007;PGEX-KGri et al2008）。ETEC腹泻在非洲、亚洲及拉丁美洲的旅行者腹泻中也占到1/3-1/2（WHO2004）。ETEC腹泻的致病机理是通过粘附素，首先粘附到宿主的小肠粘膜刷状缘上皮细胞的受体上，抵抗肠道蠕动及内容物的清洗，实现定殖后并释放一种或两种肠毒素（enterotoxin），引起细胞内水和电解质平衡失调，从而产生水样腹泻（Natro andKaper1998;Sack1980）。粘附素和肠毒素是传统ETEC疫苗研究中不可或缺的重要抗原（Svennerholm and Tobias2008）。

过去认为粘附素主要指菌毛粘附素即菌体表面菌毛抗原CFAs或CS。目前人源ETEC中已鉴定超过22种CFAs，常见的有CFA/I，CS1-CS7，CS14，CS17，CS21（Qadri et al2005），但异源菌毛间无交叉保护作用（Qadri et al2006）。另外研究发现粘附过程也需要非菌毛粘附素的参与。大肠杆菌包括ETEC均会在周身或两端生出鞭毛，数量较菌毛少，但长度是菌体的若干倍。近年来研究表明除了遍布菌体表面的菌毛外，端生的鞭毛不仅可以作为运动器官，而且这种运动性（motility）在一些革兰氏阴性菌定植、入侵及促炎反应等致病过程起作用，如沙门氏菌（Allen-Vercoe et al1999）、鸡致病性大肠杆菌（La Ragione etal2000）。

Roy等（2006）以转座质粒发现了ETEC分泌的一种蛋白EtpA，是双伴侣分泌素（TPS）的成员之一，为ETEC所特有。分布在59%的CFAI、56%的CFAⅡ、75%的CS14或CS17的ETEC菌株中，而这几种菌毛类型占据约60%的ETEC（Wolf1997）。研究阐明了EtpA在细菌粘附中是通过在胞外与鞭毛蛋白（FliC）的保守区互作，介导鞭毛与宿主细胞的桥梁作用发挥的（Roy etal2009a）。细胞试验通过缺失和重组证实这种互作对于ETEC的有效定植具有关键作用，即EtpA或fliC缺失菌株粘附细胞能力相比野生型大大降低，或在培养基中添加二者的抗体也会减少粘附的细菌数，而外源添加重组蛋白或同源重组该基因可使缺失株重新获得粘附细胞的功能（Roy et al2009a）。