[发明专利]一种借助60Co-γ射线诱变和小孢子培养创制大白菜突变体的方法

说明书

技术领域

本发明属于植物细胞工程技术领域，具体涉及一种在小孢子培养过程中结合⁶⁰Co-γ射线诱变创制大白菜突变体的方法。

背景技术

大白菜属于十字花科芸薹属A基因组植物，是我国种植面积最大的蔬菜作物。大白菜的基因组序列已经于2011年释放，其分子生物学研究进入了功能基因组阶段，构建大白菜突变体库是研究其功能基因组学的重要基础。

诱变产生突变体的方法包括物理诱变，化学诱变，T-DNA插入诱变和AC/DS 转座诱变等。物理诱变是获得突变体的常用方法，具有诱变作用强，诱发突变谱广，突变频率高，突变体易稳定，微突变类型多而且有益变异相对较多等优点。

传统的诱变处理方法，主要是处理植株的种子，在田间对诱变植株进行鉴定和选择。利用小孢子为诱变材料与诱变种子相比具有明显的优势：一是以单个小孢子细胞为单元进行诱变处理，可以在很小的空间内处理非常大的群体，可以大幅度提高诱变效率；二是在单倍体小孢子培养前进行诱变处理，一旦突变了的小孢子再生成双单倍体植株，其突变基因是纯合的, 突变性状在当代就能表现，而且后代不再分离。本发明将⁶⁰Co-γ射线辐射诱变处理与小孢子培养技术相结合，可以快速创制出纯合的大白菜突变体，加快突变体库的创建步伐。

发明内容

本发明的目的是创建一种快速创制大白菜突变体的新方法，将⁶⁰Co-γ射线处理和小孢子培养技术相结合，快速获得纯合的大白菜突变体，大幅度提高突变体库创建的效率。

本发明提供的技术方案，主要过程如下：

（1）所用的诱变材料为小孢子DH系，在开花期，选取其长度为2-4 mm的未开放花蕾，小孢子发育期为单核晚期至二核早期，用⁶⁰Co-γ射线进行辐照处理，剂量为20～60Gy，剂量率为1.58 Gy/min；

（2）从照射后的花蕾中分离纯化小孢子，进行液体浅层培养，获得再生的小孢子植株M₀代；

（3）将M₀代植株移栽到温室，用流式细胞仪鉴定其倍性，筛选出双单倍体植株；

（4）在所获得的双单倍体植株中，通过鉴定叶色、叶形、株型、花瓣颜色、花瓣形态、花瓣大小和雄蕊育性植物学性状，初步筛选出突变体植株；

（5）所有双单倍体植株自交，其中雄性不育突变体与野生型杂交，收获M₁种子；

（6）播种M₁种子，进一步鉴定突变性状，获得稳定遗传的突变体。

上述过程（2）的具体内容：将照射后的花蕾分离小孢子进行培养。花蕾在超净工作台内经浓度为75％乙醇溶液表面消毒30s后，用浓度为0.1％HgCl₂溶液消毒8 min，再用无菌水冲洗3次，每次5 min。消毒后的花蕾放入灭过菌的小烧杯内，加入蔗糖浓度为130g·L^-1，PH值为5.8的B5培养基，用无菌研棒碾压花蕾，使小孢子游离出来，用40μm孔径的尼龙网过滤含小孢子的悬浮液，收集滤液于10 mL离心管中，1000 rpm离心3 min，弃上清液，沉淀加5 mL B5培养基，摇匀，1000 rpm离心3 min，弃上清液，重复2次，所得沉淀物即为纯净小孢子。将纯化后的小孢子用NLN培养基稀释，稀释密度至1~2×10⁵个·mL^-1，以每皿5 mL小孢子悬浮液分装入直径60 mm的无菌培养皿内, 每皿添加100μL高温灭菌后的0.5g·L^-1琼脂糖和10g·L^-1活性炭混合液；用石蜡膜封口, 33℃恒温箱中暗培养24小时, 再转移至25℃培养箱暗培养10～15天，肉眼可见胚状体后，将培养皿转移到转数为40～60转/分钟摇床上继续暗培养，培养温度为25℃；将子叶期胚状体转接到MS培养基上，在25℃，16h/8h光周期条件下培养；获得小孢子再生植株后，再进一步将再生植株接种到MS培养基上进行人工诱导生根培养；