[发明专利]荧光定量PCR检测肉毒杆菌的通用型试剂盒及方法

说明书

技术领域

本发明涉及细菌的分子生物学检测技术领域，特别是涉及荧光定量PCR检测肉毒杆菌的通用型试剂盒及方法。

背景技术

肉毒杆菌是一种生长在缺氧环境下的细菌，在罐装食品及密封腌渍食物中具有极强的生存能力，摄食含肉毒杆菌的食品可引发食物中毒。肉毒杆菌是一种致命病菌，它在繁殖过程中分泌的毒素是毒性最强的蛋白质之一。人们食入和吸收这种毒素后，神经系统将遭到破坏，出现头晕、呼吸困难和肌肉乏力等症状。根据抗原性的不同，肉毒杆菌可分为8个型，分别是A、B、Cα、Cβ、D、E、F和G型。其中A、B、E、F和G型主要引发人类发病，Cα、Cβ、D主要引发动物发病。

目前检测肉毒杆菌所采用的方法主要还是传统常规的分离鉴定法、Elisa方法及普通PCR检测。传统常规的分离鉴定法，操作烦琐、耗时长、漏诊率高；ELISA方法相对简便、快速，但对于微量或杂质较多的样品，其特异性和灵敏度较低，可能造成漏诊或误诊。PCR作为一种新型的分子生物学技术，自诞生以来，由于它的特异性、敏感性高，能在短时间内得到大量的目的片段，使之成为当今发明研究的重要手段之一。但常规的PCR在操作中容易造成污染，假阳性较高，使之在诊断上受到一些限制。因此，有必要建立一种快速、灵敏、准确度高的肉毒杆菌检测方法。

定量检测技术-实时荧光定量PCR（Real-time PCR，qPCR），该方法与传统方法不同，它的优点：一是单管封闭操作，有效解决了PCR污染问题；二是自动化程度高；三是特异性更强；四是PCR反应的实时监控。有效地解决了传统定量只能终点检测的局限，实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度，并记录在电脑软件之中，通过对每个样品Ct值的计算，根据标准曲线获得定量结果；五是绝对定量，由于Ct值与起始模板的对数存在线性关系，可利用标准曲线对未知样品进行绝对定量测定。SYBRGreen染料法已是较完善的检测体系，且反应体系中SYBRGreen染料的使用浓度亦不用进行调整优化，整个检测体系简单易行，但用SYBRGreen染料法进行Real-timePCR也存在着一定的弊端，如结果需要进行熔解曲线分析，特别是进行多重基因检测或引物质量不好时，其扩增的原始图则不能直观反映真实的扩增效率，必需经熔解曲线分析来确定最终的发明结果。实时荧光定量PCR技术自产生以来，不断发展完善，到目前为止已经非常成熟了。标记方法由最初单一的染料法，发展到了特异性更高的探针法，如Taqman、Molecular Beacon等。

发明内容

本发明的一个目的是提供荧光定量PCR检测肉毒杆菌的通用型试剂盒，使其能够快速、有效地检测8个型肉毒杆菌，准确性、特异性和敏感性高，稳定性好，实现对待测样品如食品、血液及组织样品的快速诊断和有效检测。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

荧光定量PCR检测肉毒杆菌的通用型试剂盒，包括PCR反应液，所述PCR反应液包括具有如下核苷酸序列的引物对和Taqman探针：

上游引物：5’-TGCCTAAAATAGGAATCGATGAA-3’，

下游引物：5’-CCACCATTGATCTAAGAAGTCATAG-3’，

Taqman探针:5’-ACCTAATAGTATGTTGAATC-3’。

进一步地，所述Taqman探针的核苷酸序列的3’端标记MGB荧光淬灭基团。

进一步地，所述Taqman探针的核苷酸序列的5’端标记HEX或FAM荧光报告基团。

进一步地，所述PCR反应液还包括2×Premix EX Taq。

进一步地，所述试剂盒还包括阳性对照、阴性对照，所述阳性对照为肉毒杆菌基因组DNA。

本发明的另一个目的是提供荧光定量PCR检测肉毒杆菌的方法，可快速地检测8个型肉毒杆菌，且准确性、特异性和敏感性较高。采用如下技术方案：

荧光定量PCR检测肉毒杆菌的方法，采用具有如下核苷酸序列的引物和Taqman探针进行荧光定量PCR：

上游引物：5’-TGCCTAAAATAGGAATCGATGAA-3’，

下游引物：5’-CCACCATTGATCTAAGAAGTCATAG-3’，

Taqman探针:5’-ACCTAATAGTATGTTGAATC-3’。

进一步地，所述Taqman探针的核苷酸序列的5’端标记HEX报告荧光基团，3’端标记MGB淬灭荧光基团。