[发明专利]用于检测食品和饲料中貉成分的引物和探针

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用核酸扩增技术进行动物源性成分快速检测的方法，具体是一种貉成分的实时荧光PCR检测用的引物和探针序列。

背景技术

貉，别名称狸，在动物学分类上属哺乳纲，食肉目，犬科（Canidae），貉属（Nyctereutes）。主要分布于前苏联各国、中国、朝鲜、日本、蒙古、芬兰等国家，在我国几乎各省区均有分布。貉是一种珍贵的毛皮动物，貉皮属大毛细皮、具有坚韧耐磨、轻便柔软、美观保温等优点，是制作大衣、皮领、帽子和皮褥等裘皮制品的优质原料。貉的针毛和尾毛可用于制作高级化妆用毛刷、胡刷和毛笔等。貉可入药，其胆、睾丸是名贵中药材，貉油具有烫伤药用价值，也是开发化妆品的上等原料。貉经济价值高，且适应性较强，易于驯养繁殖，饲养管理较为简单，因此养貉业发展十分迅速，其养殖业已成分现代畜牧业的一个重要组成部分。目前人工养殖的貉，以黑龙江省的乌苏里貉为最多。

貉主要作为一种皮毛经济动物，养殖过程中有时需要添加激素类饲料，并且要定期注射一些抗生素药品，因此体内常残留超标的激素和抗生素，故貉肉不作为人类常用肉类供人食用。近年来，一些不法商贩，受利益驱动，低价收购未经检验检疫的貉肉，加工后冒充狗肉、羊肉，甚至制成肉卷、肉串、香肠等谋取暴利。这种制售假冒制品的行为，不仅可能危害人类健康，还涉及到宗教信仰问题，严重损害了消费者的利益。随着疯牛病和禽流感等疾病的流行和食品贸易的全球化, 消费者迫切地要求知晓食品的确切成分，世界各国都制定了相应的标签制度，要求在食品标签中明确动物源性制品的种类和来源。此外，饲料安全也直接关乎食品安全，包括我国在内的欧盟、美国等很多国家先后颁布多个法规，规定禁止在反刍动物饲料中使用、添加以哺乳类动物为原料的动物性饲料产品，以有效防止哺乳动物的病原体从动物传染到别的动物和人类。鉴于此，尽快建立可靠有效的貉成分检测方法，对于确保食品和饲料标签真实准确，加强食品和饲料标识管理，改进食品安全，保护消费者利益具有重要意义。

食品和饲料中动物源性成分检测，常采用DNA检测的方法。以DNA为测试对象的方法与以蛋白为测试对象的方法相比，在成分复杂的情况下，目标DNA可以有效提取，受基质的影响较小；此外，DNA比较稳定，不象蛋白质组成那样容易受到外界环境因素和加工工艺的影响。当前，基于DNA的检测方法中，实时荧光PCR法以其操作简便、灵敏、特异、快速、重复性好、定量准确、全封闭反应等优点，得到研究者的普遍认可，成为检测的重要工具。

发明内容

本发明要解决的技术问题是针对貉线粒体细胞色素C氧化还原酶Ｉ亚单位基因，设计一组特异性引物和探针，进而建立一种高灵敏度高特异性快速检测貉DNA方法，以克服基于蛋白的检测方法在某些食品和饲料检测中的局限性，为貉成分检测提供有效工具，从而确保食品和饲料标签的一致性，保护消费者利益。

本发明的主要原理为：针对保守序列设计一组引物（上游引物：5'- AATCTTGCCTGGGTTTGGAA -3'和下游引物：5'- CAGTAAATATGTGGTGGGCTCACA -3'）和一条Taqman-MGB探针（序列为：5'- CATACTACTCCGGGAAAA -3'）。进行核酸检测时，模板DNA经加热至94-95℃一定时间后，DNA双链解离，引物及Taqman探针与模板特异性结合。探针的5端标记有报告荧光集团，3端有淬灭荧光集团。当探针完整的时候，报告集团所发射的荧光能量被淬灭集团吸收，仪器检测不到信号。随着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中，遇到与模板结合的探针时，其3'→5'外切核酸酶活性就会将探针切断,报告集团远离淬灭集团,其能量不能被吸收,即产生荧光信号。随着PCR循环的增加，目的片段成指数增长，荧光信号也同步增强，荧光信号的强弱直接反映模板数量。

本发明涉及的貉成分实时荧光PCR检测用的引物和探针，其序列如下：

（1）上游引物：5'- AATCTTGCCTGGGTTTGGAA -3'；

    （2）下游引物：5'- CAGTAAATATGTGGTGGGCTCACA -3'；

（3）TaqMan-MGB探针：5'- CATACTACTCCGGGAAAA -3'； 

    在应用中，上游引物、下游引物、TaqMan探针的体积比为：1:1:1；

使用上述试剂盒检测食品中貉成分的方法，依次包括下列步骤（1）-（3）：

（1）待检样品DNA的提取

DNA 提取可采用普通酚-氯仿抽提法或使用DNA 提取试剂盒。

（2）貉成分的实时荧光PCR扩增