[发明专利]用于人类耳聋多基因突变筛查的引物、探针及其使用方法

说明书

技术领域

本发明属于基因检测技术领域，特别涉及用于人类耳聋多基因突变筛查的引物、探针及其使用方法。

背景技术

耳聋是严重影响人类健康的一种常见疾病，也是临床上最常见的遗传性疾病之一，因其病因复杂、发生率高且治疗困难，从而极大的影响着患者的人际交往与生活质量。据统计，耳聋在新生儿中的发病率约为1‰～3‰，全世界约有7000万人罹患不同程度的听力缺损，而我国是世界上听力障碍人口最多的国家，在全国各类残疾人中，听力残疾约占总数的24%，累及全国数千万个家庭。

耳聋的致病因素有很多，包括遗传因素和环境因素等，其中约50%-60%由遗传因素导致，即遗传性耳聋。在大量迟发性听力下降的患者中，许多也是由于自身基因缺陷或由于基因缺陷和多态性造成对环境因素的易感性增加而致病。根据是否伴有耳外组织的异常或病变，遗传性耳聋分为综合征性耳聋（SHL）和非综合征性耳聋（NSHL），其中NSHL占70%甚至更多。而根据遗传方式的不同又可将遗传性耳聋分为常染色体显性遗传（DFNA）、常染色体隐性遗传（DFNB）、X连锁遗传、Y连锁遗传及线粒体遗传五类，其中以DFNB最为常见，约占60%～75%；其次为DFNA，约占20%～30%。一般情况下，DFNB多表现为语前聋或先天性耳聋，DFNA多表现为语后聋或渐进性听力下降。

随着基因组学以及分子生物学技术的迅猛发展，对于遗传性耳聋相关基因及发病机制的研究已经取得了很大的进展。研究发现，在70%～80%的遗传性耳聋患者中可发现致聋基因突变，已知有数百个基因与遗传性耳聋有关，且绝大多数的遗传性耳聋为单基因病，而耳聋相关的遗传基因突变在正常群体中也并不少见，在我国现有人口中，携带遗传性致聋基因的比例约为6%。研究结果还表明，遗传性耳聋的致病基因及同一基因的突变位点在不同种族，甚至在同一种族的不同地区的人群中都不完全相同。目前，欧美发达国家列入耳聋致病基因临床检测的项目包括EYA1、TIMM8A、GJB2、GJB6、SLC26A4、USH2A、USH3A、POU3F4、WFS1、COCH、OTOF、TECTA以及线粒体DNA（mtDNA）等，但最普遍也是最基本的检测项目是GJB2、GJB6、SLC26A4、COCH和mtDNA基因的突变检测。而国内进行的耳聋分子流行病学调查结果显示，我国大部分的遗传性耳聋主要由GJB2、GJB3、SLC26A4以及mtDNA等为数不多的几个基因突变引起，对这几个基因进行遗传学检测可以明确耳聋人群中40%的遗传学病因，结合家族史分析和查体可以诊断95%以上的遗传性耳聋，这为我国耳聋致病基因筛查以及临床基因诊断工作的大规模开展提供了理论依据。

GJB2基因定位于13ql12q12上，含2个外显子，是NSHL最常见的致病基因，已被证实与常染色体隐性遗传性耳聋（DFNB1）和显性遗传性耳聋（DFNA3）有关，其编码的连接蛋白26（connexin26）表达于耳蜗，参与细胞间信号介导和离子传递。突变的GJB2基因可导致连接蛋白异常，进而影响细胞间隙的连接功能，引起内耳钾离子回收障碍而致耳聋。GJB2基因突变是中国人散发性先天性耳聋的主要病因，且有26%-33%的语前聋患儿为GJB2基因突变所致。目前在NSHL病人中已经发现了100多种GJB2基因突变类型，其主要突变类型包括35delG、167delT、235delC、V37I、299-300delAT、R143W、W24X等，这些突变类型在不同种族人群中的发生频率和分布情况差异很大，其中35delG为高加索人的致病热点突变，而我国的致病热点突变则为235delC。

GJB3基因于1998年由夏家辉等研究中国两个常染色体显性遗传非综合征性耳聋的家系时定位并克隆，该基因定位于人类染色体1p33-p35，编码由270个氨基酸组成的连接蛋白31（connexin31）。GJB3突变既可导致DFNA，又可导致DFNB，其错义突变E183K和无义突变R180X被认为与高频听力下降有关，复合杂合突变423-425delATT和423A-G能导致隐性非综合征性耳聋。多项研究结果表明，GJB3基因突变在中国耳聋人群中的携带率约为3%。