[发明专利]家蚕W染色体适合转基因定点插入的靶序列及其位点和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种核苷酸序列，具体涉及家蚕W染色体上适合转基因定点插入的靶序列及其位点，还涉及该靶序列和位点在转基因定点插入报告基因表达盒中的应用。

背景技术

家蚕是具有重要经济价值的鳞翅目昆虫，蚕丝业是许多地区农民的主要经济收入来源之一，蚕丝业为世界经济、文化、社会发展做出了重要贡献。优良蚕品种选育一直都是蚕业科学研究的重点和蚕桑业发展的基础，传统良种选育的主要目标是高产和优质。

家蚕的体细胞染色体数是28对，其中27对是常染色体，另外一对是性染色体。在雌蚕中，性染色体不成对，叫做ZW；在雄蚕中成对，叫做ZZ。雌蚕可以产生两种卵，一种是27+W，一种是27+Z，两种卵的比数相等；而雄蚕只能产生一种精子，即27+Z。带有W的卵跟带有Z的精子结合，得到ZW合子，发育成为雌蚕；带有Z的卵跟带有Z的精子结合，得到ZZ合子，发育成为雄蚕。因此，家蚕是ZW型性决定，雌蚕是异配性别，雄蚕是同配性别，下代个体的性别是由卵细胞带的是Z染色体还是W染色体决定。

蚕种分为母种和杂交种，蚕种生产单位饲养母种并制备杂交种，蚕农饲养杂交种。雄蚕在体质抗性、饲料效率、茧丝品质等方面都优于雌蚕，因此蚕农希望能够单养雄蚕。但蚕种生产单位必须同时饲养多个母种的雌雄个体，并在制种前将雌雄个体分开，以防止自交。在短短的几天蛹期对大量的蚕蛹进行雌雄鉴定，不但工作量非常大，而且不能保证100%正确。培育具有W染色体连锁标记基因的限性品种成为解决以上两个问题的有效方法，限性品种能够根据其限性特征在非破坏条件下鉴别雌雄。培育限性品种的传统方法主要是通过杂交的方式，将已有限性品种的卵色、体色、茧色等限性性状导入实用品种，再经过很多代长时间的回交选纯，最后培育成生产品种。但是，这种方法具有很大局限性，比如：在导入限性性状的同时带入了其他不良性状、限性性状不稳定导致后代出现分离、选育周期过长，等等。因此，要克服传统育种方法的这些缺点，需要利用新的技术和方法。

转基因技术是将人工分离和修饰过的基因片段导入到生物体基因组中的一种方法，导入基因的表达将引起生物体性状的可遗传修饰。目前，转基因技术已经成为现代生物学研究中的一项重要技术，在基因功能研究、生物素材创新、品种遗传改良等方面发挥着重要作用。合适的转座子是转基因成功的重要条件，piggyBac转座子首次从杆状病毒侵染粉纹夜蛾（Trichoplusia ni）昆虫TN-368细胞株系时分离得到，它是一种DNA型转座子。piggyBac转座子长2476bp，含有ITR（13bp）和2个RNA聚合酶Ⅱ启动子及1个聚腺苷酸信号，在该信号的侧面是一个编码转座酶的ORF，该转座子总是在TTAA目标位点处特异插入。piggyBac转座子能够准确切除DNA片段并将其插入到基因组中，插入片段遵循孟德尔遗传规律被稳定遗传；而且它携带的基因片段大小没有限制，引起的染色体整合频率也较高。因此，piggyBac转座子目前已经在很多物种中广泛使用。经过研究人员的长期摸索证明，piggyBac转座子是最适合家蚕转基因的转座子。

利用转基因技术，在W染色体特异插入一个标记基因或者条件性致死基因，是制备雌特异转基因家蚕的有效方法。但是，家蚕W染色体上面包含大量的重复序列，基因组测序工作目前尚未完成，而且W染色体上的大量转座元件会抑制插入基因的表达。因此，要找到一条适合转基因插入的W染色体序列非常困难。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供家蚕W染色体上适合外源片段定点转基因插入的靶序列；本发明的目的之二在于提供家蚕W染色体适合转基因定点插入的位点；本发明的目的之三在于提供家蚕W染色体适合转基因定点插入的位点的应用。

为实现上述发明目的，提供如下技术方案：

家蚕W染色体适合转基因定点插入的靶序列，所述靶序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示。

优选的，所述靶序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.19第1-120位所示。