[发明专利]红锥SSR8标记、引物对及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种红锥SSR标记，其特征在于具有序列表SEQ.ID.No.1的碱基序列，微卫星标记编号为SSR8。

2.扩增权利要求1所述红锥SSR标记的引物对HZ8，其特征在于包括具有序列表SEQ.ID.No.2和SEQ.ID.No.3的碱基序列。

3.权利要求1所述红锥SSR标记的制备方法，其特征在于利用特定引物对HZ8对红锥总DNA进行PCR扩增，得到简单重复序列；所述引物对HZ8包括具有序列表SEQ.ID.No.2和SEQ.ID.No.3的碱基序列。

4.根据权利要求3所述红锥SSR标记的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

<1>红锥总DNA提取与酶切

选取红锥幼嫩的叶片，用CTAB法提取核基因组；用EcoRV在37℃下酶切3-8h或一晚，65℃下8-20min灭活内切酶；反应体系20μL，包括2.0μL的10×Buffer，1.0μL的EcoRV内切酶，2μL的DNA，15.0μL的灭菌双蒸水；

<2>接头的连接

将步骤<1>EcoRV酶切的红锥基因组DNA连接上下接头；20-60μL连接体系中含有酶切的红锥基因组DNA4-9μL，上下接头各100pmol；连接反应在T4连接酶缓冲条件下进行，于16℃连接过夜；连接后的混合物在65℃反应8-20min，灭活连接酶；

<3>连接产物的扩增

过夜步骤<2>连接后的混合物以AP2和复合SSR引物为上下引物对连接后的混合物进行PCR扩增；1.5-2.0%的琼脂胶电泳，切胶回收500-1000bp的片段，试剂盒纯化；

<4>克隆并筛选富集的微卫星DNA片段

将步骤<3>PCR产物连接到载体pMD18-T Vectors上，然后转化到感受态细胞E.coil中，涂布到含有Amp的平板培养基上，37℃培养过夜；用M13引物进行PCR扩增检测，选取400-1000bp左右的片段；

<5>测序、引物设计与扩增分析

将步骤<4>PCR产物送测序；利用Primer5.0软件对测序结果进行SSR引物设计并送合成，得引物对HZ8；利用引物对HZ8在红锥基因组中扩增出片段SSR8标记。

5.权利要求4所述红锥SSR标记的制备方法，其特征在于：

步骤<2>中上下接头分别具有序列表SEQ.ID.No.4和SEQ.ID.No.5的碱基序列；

步骤<3>中AP2和复合SSR引物分别具有序列表SEQ.ID.No.6和SEQ.ID.No.7的碱基序列；步骤<4>中M13引物对具有序列表SEQ.ID.No.8和SEQ.ID.No.9的碱基序列；

步骤<5>中引物对HZ8分别具有序列表SEQ.ID.No.2和SEQ.ID.No.3的碱基序列。

6.权利要求5所述红锥SSR标记的制备方法，其特征在于步骤<5>中扩增按以下操作进行：

扩增体系：反应体系10μL，包括30-50ng的模板DNA，0.25个单位的DNA聚合酶（TaKaRa），1.0μL的10×Buffer，2.5mM MgCl₂1μl,2.5mM dNTPs1μl,0.1μl bovine serumalbumin(BSA)；

扩增程序：95℃预变性5min;95℃变性30s,52℃复性45s,72℃延伸1min30s,30个循环;最后72℃延伸10min。

7.权利要求1所述红锥SSR8标记在红锥的分子标记辅助育种方面的应用。

8.权利要求1所述红锥SSR8标记在红锥的QTL研究方面的应用。