[发明专利]表达猪O型口蹄疫病毒VP1蛋白的重组牛副流感病毒载体

说明书

技术领域  

本发明涉及一种表达猪O型口蹄疫病毒VP1蛋白的重组牛副流感病毒载体，特别是一种表达猪口蹄疫病毒结构蛋白VP1基因的重组牛副流感病毒3型载体的构建方法和重组病毒的生物学特性，属于分子生物学和病毒学领域。

背景技术  

副流感病毒对不同种类的动物而言，由于自然宿主范围的限制性，毒力是减弱的。因此，可以将异源性病毒保护性抗原基因插入到减毒的副流感病毒中，以此为载体表达异源性病毒的保护性抗原，以 BPIV3 为载体表达人呼吸道合胞体病毒的保护性抗原，即可保持 BPIV3 在人体内的弱毒性，又可以维持人呼吸道合胞体病毒保护性抗原在人体内的免疫原性(Haller et al., 2003)。作为病毒载体的副流感病毒不仅具有能在宿主细胞内高效繁殖的能力，而且能够通过鼻腔内免疫途径达到高效感染的效果，有效地诱导局部体液免疫抗体的产生和细胞免疫产生的保护性免疫应答。作为载体的副流感病毒感染宿主细胞后，只在细胞质中增殖，不会造成宿主细胞的死亡和损伤，其遗传物质也不会整合到宿主细胞基因组中，因此不会造成宿主细胞的变异(Ambrose et al., 1995)。副流感病毒的基因组为单股负链不分阶段的 RNA，各基因片段相互不重叠。其表达是以单个独立的 mRNA 单位进行。所以其基因间的区域便于外源基因的插入和调节，并有利于外源基因稳定性的维持。

典型的副流感病毒基因组复制模式为：病毒 RNA 聚合酶在基因起始(gene start，GS)和基因终止(gene end，GE)信号的指导下，从病毒基因组 RNA 3’末端依次对病毒基因组进行复制。GS和 GE 指导每个基因的转录起始和终止产生单个 mRNA，构成了基因的上下游限制区(Takeda and Yanagi, 2006)。病毒启动子存在于基因组 RNA 的 3’端，每个基因的 GS 和 GE 限制区通常由不超过 200 个核苷酸的短序列组成(De et al., 1990)，所以顺式作用信号比较短。副流感病毒作为病毒载体表达外源性抗原的关键是转录单元的构建，构建方法是将获得的完整外源基因开放式阅读框的 cDNA 片段两端分别加上副流感病毒基因片段间特有的 GS 和 GE 信号序列，具体操作方法是在 GS 和 GE 信号序列两端分别加上和副流感病毒载体插入位点相适应的酶切位点。通过酶切、连接等一系列操作将此转录单元插入到副流感病毒载体中。在拯救的重组病毒中，外源基因象病毒本身的基因组一样作为独立的 mRNA 被表达(王曲直等, 2008)。外源基因片段必须插到基因间的非编码区，或第一个基因的引导序列之后，才能得到有效表达(Ammayappan et al., 2010)。副流感病毒基因组象其它副黏病毒亚科的病毒基因组一样的，长度必须是 6 的整数倍，才能高效复制(Skiadopoulos et al., 2003)，这种现象称为 “6 碱基原则”，因此，插入外源基因片段的长度和组成必须符合“6 碱基原则”，只有这样插入的基因才能得到有效表达(Nagai and Kato, 2004; Skiadopoulos et al., 2003)。以牛副流感病毒 3 型为载体表达人呼吸道合胞体病毒蛋白对预防人类呼吸道疾病有重要意义，以 BPIV3 为载体通过反向遗传操作系统将人呼吸道合胞体病毒G和F基因插入到其基因组中HN 基因的下游，通过免疫学检测结果表明人呼吸道合胞体病的 G 和 F 基因都能够在重组病毒内高水平表达，均能被细胞膜上的受体所识别，并被细胞蛋白酶水解酶准确水解，发挥生物学活性，并且不影响载体基因的表达(Crowe, 1995; Haller et al., 2003; Schmidt et al., 2001；王曲直等, 2008)。外源糖蛋白基因可以为病毒载体带来新的功能，如抗原重组病毒表达的外源糖蛋白掺入到载体病毒颗粒中，抗原嵌合病毒依赖这些外源糖蛋白代替缺失的载体糖蛋白发挥功能，从而显示出新的生物学特性。 

发明内容    

本发明的目的在于提供一种表达猪O型口蹄疫病毒VP1蛋白的重组牛副流感病毒载体，其重组表达猪口蹄疫病毒VP1结构蛋白基因的新型基因工程载体，为牛副流感病毒3型作为新型基因工程疫苗载体提供技术支持；为进一步开发防控猪口蹄疫的基因工程重组疫苗和研究牛副流感病毒 3 型毒力因子以及分子致病机理奠定基础。