[发明专利]一种羧酸酯酶D-1CarE3细胞表面展示系统及全细胞催化剂其制备方法及应用

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术和分析技术领域，涉及一种羧酸酯酶D-1CarE3细胞表面展示系统及全细胞催化剂其制备方法及应用。 

背景技术

羧酸酯酶（Carboxylesterases,EC3.1.1.1）是一类能够催化水解羧酸酯生成羧酸和醇的非特异性酯酶，广泛存在于动物、植物、微生物体参与生命代谢活动，其与脂肪酶同属于α/β水解酶家族成员，具有Ser-Asp-His三联体结构催化活性中心。微生物来源的羧酸酯酶是一种重要的工业酶类，在催化酯水解、酯合成、酯交换上等具有重要应用价值，具有良好的区域选择性和立体选择性。这些独特性质使羧酸酯酶在食品、化工、制药、能源开发和环境保护等领域具有广阔的应用前景。 

当今农药在控制农作物病虫害促进农作物增产的同时也带来了严重的环境污染问题。羧酸酯酶是一种重要的农药降解酶，对含有羧酸酯键的农药有水解作用，可以用于部分有机磷类农药、氨基甲酸酯类农药以及拟除虫菊酯类农药的降解。微生物降解农药残留多数是依靠胞内酶的酶解作用，但由于野生菌株产酶能力有限、生长周期长、收集复杂、产量小，生产成本高，限制了其推广应用。利用细胞表面展示技术可以将靶蛋白羧酸酯酶转运和定位到细胞表面，无需分离纯化，是一种开发高效、可再生全细胞催化剂的新思路，适合工业大规模生产应用。 

冰核蛋白的N端具有表面定位功能，而C端具有细胞表面引导和定位功能，利用NC端则有利于提高其对外源蛋白的高效展示作用。本文利用来源丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae）的人工合成截短的冰核蛋白（Genbank登录号AF013159）的NC端为锚定蛋白与来源脂环酸芽孢杆菌D-1（Alicyclobacillus tengchongensis strainCGMCC1504）靶蛋白羧酸酯酶D-1CarE3（Genbank登录号JQ034612）融合构建了原核表达质粒pET28NCD3，并将其转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，构建了羧酸酯酶D-1CarE3的大肠杆菌细胞表面展示工程菌BL21(DE3)/pET28NCD3。利用低温冷冻干燥法制备了全细胞催化剂D-1CarE3，并将其应用于氟氯氰菊酯的降解实验中，结果表明该全细胞催化剂对拟除虫菊酯农药氟氯氰菊酯有降解作用，此外发明专利“一种羧酸酯酶及其在农药马拉硫磷和西维因的降解中的应用”（申请 号：201210401222.4）还公开了该羧酸酯酶D-1CarE3具有降解有机磷类农药中的马拉硫磷和氨基甲酸酯类农药中的西维因，这些表明细胞表面展示羧酸酯酶D-1CarE3的全细胞催化剂可应用于环境多种农残污染的处理。 

发明内容

为了克服现有技术中存在的缺陷，本发明提供一种环境友好、操作方便的羧酸酯酶D-1CarE3细胞表面展示系统及全细胞催化剂其制备方法及应用。其技术方案如下： 

一种羧酸酯酶D-1CarE3细胞表面展示系统，该细胞表面展示系统中利用了人工合成截短的冰核蛋白inaK的NC端作为锚定蛋白并与靶蛋白羧酸酯酶D-1CarE3融合构建了重组质粒pET28NCD3。 

一种羧酸酯酶D-1CarE3细胞表面展示工程菌，利用本发明所述中的重组质粒pET28NCD3转化到表达宿主BL21(DE3)构建了细胞表面展示工程菌BL21(DE3)/pET28NCD3。 

一种包含本发明所述工程菌BL21(DE3)/pET28NCD3全细胞催化剂D-1CarE3的制备方法，其特征在于，取本发明所述工程菌株以0.1%的体积比接种量接种于含50μg/mL卡那抗性的LB培养液中，37℃快速振荡12h，然后将此活化的菌液再以1%体积比接种量接种到新鲜的LB诱导培养液中，37℃振荡培养4h，待菌体密度OD600=0.5左右，加入终浓度0.05mMIPTG20℃诱导培养20h，12000rpm离心5min，收集菌体，置于超低温冷冻真空干燥机上冻成细胞干粉即为全细胞催化剂D-1CarE3。 

全细胞催化剂D-1CarE3在环境农残污染处理中的应用。称取1mg权利要求3所述全细胞催化剂D-1CarE3加入100μl100mg/ml的氟氯氰菊酯丙酮溶液中室温震荡反应60min,加入等体积的正己烷抽提，离心取上层液适量于硅胶G板上进行簿层层析分析催化产物，结果显示全细胞催化剂D-1CarE3能够降解拟除虫菊酯农药氟氯氰菊酯，可应用于环境农残污染的处理。