[发明专利]一种抗菌肽[L6, K11]-IsCT及其制备方法以及抗菌肽[L6, K11]-IsCT的应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说是一种抗菌肽[L⁶, K¹¹]-IsCT及其制备方法以及抗菌肽[L⁶, K¹¹]-IsCT的应用。

背景技术

抗菌肽具有较好的广谱抑菌性能，对大肠杆菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌等都有不同程度的抑制作用。近年研究发现许多抗菌肽对某些真菌、病毒及癌细胞等也均具有强有力的杀灭活性。近年来，抗生素作为添加剂在猪饲料上泛滥使用，它可以破坏猪肠道内正常菌群，不喂抗生素时抵抗力差，身体正常发育受影响，而人类在食用后，抗生素就会积蓄在体内，使人体产生大量的耐药菌株，最终导致人体抗药性的增加。 相对于抗生素而言，具有无残留、效价高、无毒害作用等优点是抗生素潜在的替代品。

蝎子是我国的一种传统名贵中药，2000多年前就记载了蝎子的药用史。其具有抗肿瘤，杀虫，抑菌和抗菌功效，其作用主要来源于蝎尾毒腺分泌的毒液。毒液的主要成分是一类由10-100个氨基酸组成的具有多种生物活性的小分子多肽，它们可以选择性、特异性的与细胞膜上的膜蛋白相互作用，从而改变细胞对离子的通透能力，调节细胞体积、pH、膜电位、兴奋性等多种细胞代谢过程和细胞分泌、激素作用和信号转导等多种生理过程。因此，从蝎毒素中提取出的抗菌肽具有重要的理论研究意义和应用开发价值。

是来源于马达加斯加黑爪蝎(Opisthacanthus madagascariensis)毒液里的一种细胞毒性的(cytotoxic)线性肽，其分子量为1502.9Da，由不含半胱氨酸的13个氨基酸残基组成，富含疏水氨基酸（3个Ile，2个Leu）和碱性氨基酸（2个Lys），具有良好的抑菌性能，但由于对哺乳动物红细胞具有溶血活性,所以其应用受到了一定的限制。

有报道指出，作为IsCT的衍生物，[L⁶, K¹¹]-IsCT具有极低的溶血性，其分子量大小为1459 Da，有着广泛的应用前景，目前,。为该类产品在动物饲料中的应用奠定理论基础。

发明内容

本发明的目的是设计合成抗菌肽[L⁶, K¹¹]-IsCT基因，导入毕赤酵母中表达，制备猪饲料添加剂，代替目前饲料中适用的抗生素，以达到预防和治疗猪疾病，克服滥用抗生素带来的不良后果以及降低生产成本的目的。

一种新型合成抗菌肽，包括如下序列：ILGKILKGIKKLF 。

进一步，所述抗菌肽序列相应DNA序列为：5’ATT TTG GGT AAG ATT TTG AAG GGT ATT AAG AAG TTG TTT 3’。

一种抗菌肽[L⁶, K¹¹]-IsCT的制备方法包括以下步骤：（1）、根据抗菌肽[L⁶, K¹¹]-IsCT蛋白质序列及毕赤酵母密码子偏好设计该抗菌肽基因序列5’ATT TTG GGT AAG ATT TTG AAG GGT ATT AAG AAG TTG TTT 3’；

（2）、在目的基因的5’端加上编码Kex2切割位点的序列与Not Ⅰ酶切序列，在3’端加上Flag标签与终止密码子和Not Ⅰ酶切序列；

（3）、通过PCR得到两个目的基因的PCR产物，然后通过Sac Ⅱ与 Not Ⅰ双酶切连接到载体pPICZαA构建重组质粒；

（4）、将重组质粒pPICZαA-IsCT导入毕赤酵母中构建重组毕赤酵母；

（5）、在含ZeocinTM的YPDZ固体培养基上培养获取单体克隆；

进一步，步骤（5）培养基配方：

酵母提取物        1.0 g

蛋白胨            2.0 g

葡萄糖            2.0 g

ZeocinTM          100 μL

琼脂              2.0 g

加水至100 mL

培养条件：30 ℃；

（6）、挑取单体克隆与BMGY培养基中培养；

进一步，步骤（6）培养基配方：

酵母提取物        2.0 g

蛋白胨            4.0 g

YNB               2.7 g

水                160 mL