[发明专利]具有骨向分化和血管发生的组织工程细胞片的制备方法

权利要求书

1.一种具有骨向分化和血管发生的组织工程细胞片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）骨髓间充质干细胞的分离：健康成年大鼠，麻醉后处死，用体积浓度为75%的酒精浸泡约10min，无菌条件下取四肢长骨，除去骨表面附着的软组织，用PBS缓冲液清洗干净；将两端干骺端切除，显露骨髓腔；用体积浓度为10%的FBS的低糖DMEM培养液彻底冲洗骨髓腔，然后依次用7号针头和5号针头的注射器反复冲打冲出的骨髓，使骨髓细胞充分分散，制成单细胞悬液，再接种于培养瓶内，在37℃、体积浓度为5% CO2培养箱中培养12h后更换培养液，弃去未贴壁细胞，之后每2-3天换液1次；贴壁细胞融合80%以上后，结束原代培养；

（2）骨髓间充质干细胞传代扩增培养：将步骤1原代培养后的细胞用1ml质量体积比为0.25%胰蛋白酶消化约2min，待细胞形态开始皱缩，用含体积浓度为10%的胎牛血清的DMEM培养液3ml终止消化，移入离心管，1500rpm离心约5min，弃上清，加入含体积浓度为10%胎牛血清的低糖DMEM培养液，按1:3比例传代培养，得到第一代骨髓间充质干细胞，继续传代培养至得到第三代骨髓间充质干细胞；

（3）间充质干细胞片的培养：将步骤2得到的第三代骨髓间充质干细胞用1ml质量体积比为0.25%胰蛋白酶消化2min后接种在培养瓶中，接种密度为1×10⁴ cells/cm²，在α-MEM培养液，37℃恒温、体积浓度为5％C02饱和湿度培养箱内培养7天后，细胞在底部形成了层状结构，将融合的细胞从培养瓶上分离下来得到即得到具有骨向分化和血管发生的组织工程细胞片。