[发明专利]应答蜕皮激素的家蚕卵黄原蛋白启动子及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物化学领域，具体涉及一种应答蜕皮激素家蚕卵黄原蛋白启动子，还涉及该启动子的制备方法和应用。

背景技术

家蚕是重要的经济昆虫，为中华民族文化经济社会的发展做出了极为重要的贡献。同时，其遗传背景清楚，遗传资源丰富，又是国际公认的鳞翅目模式昆虫。卵黄原蛋白（vitellogenin，Vg），是卵黄磷蛋白的前体，是昆虫卵发育和成熟必须的营养组分之一，并且该基因在蛹期特异表达。已有的报道显示，昆虫Vg的转录受到激素和营养信号的共同调控，如：果蝇3个卵黄蛋白（yp1，yp2，yp3）在脂肪体和卵的滤泡细胞中表达，其表达由组织特异性因子、保幼激素和蜕皮激素共同调控；蚊子Vg在雌蚊成虫食血后开始高量表达，这种时期特异性是受蜕皮激素和氨基酸介导的营养信号通路共同调控。而家蚕卵黄原蛋白（BmVg）是在雌虫蛹期特异高量表达的，蛹期对于家蚕来说是个变态发育的关键时刻，组织器官更新，代谢旺盛。但是，目前并不清楚家蚕卵黄原蛋白是如何调控的，因此家蚕卵黄原蛋白BmVg启动子的开发，对于揭示这个过程的很多重要基因的功能以及这些基因在变态期是如何受激素调控的机理是一个理想的工具。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供应答蜕皮激素家蚕卵黄原蛋白启动子；本发明的目的之二在于提供家蚕卵黄原蛋白启动子的制备方法；本发明的目的之三在于提供含有家蚕卵黄原蛋白启动子的重组表达载体；本发明的目的之四在于提供家蚕卵黄原蛋白启动子的应用。

为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

应答蜕皮激素的家蚕卵黄原蛋白启动子，所述家蚕卵黄原蛋白启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。

2.所述家蚕卵黄原蛋白启动子的制备方法，以家蚕品种p50上蔟三天基因组为模板，SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示序列为引物进行PCR扩增。

优选的，所述PCR扩增的条件为94℃预变性4分钟；94℃变性40秒，55℃退火30秒，72℃延伸80秒，共30个循环；最后72℃延伸10分钟，4℃保存。

3.含有所述家蚕卵黄原蛋白启动子的重组表达载体。

优选的，所述重组表达载体由SEQ ID NO.11所示核苷酸序列连入细胞转染载体pGL3 basic的XhoI和HindIII酶切位点处而得。

4.所述家蚕卵黄原蛋白启动子在制备蜕皮激素诱导表达的重组载体中的应用。

本发明的有益效果在于：本发明公开了一种应答蜕皮激素的家蚕卵黄原蛋白启动子，通过分析家蚕卵黄原蛋白基因表达谱发现，家蚕卵黄原蛋白在变态发育期高表达，然后利用蜕皮激素和保幼激素分别处理体外培养家蚕脂肪体发现，BmVg受蜕皮激素诱导表达，并存在时间和浓度依赖性，对启动子分析发现BmVg启动子含有3个BrC结合元件，并且能够与BmBrC-Z2蛋白特异结合，因此可以得出BmVg启动子受蜕皮激素的调控表达，可作为一个蜕皮激素调控靶标基因的模式启动子。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：

图1.BmVg的转录与激素的关系（A：雌家蚕变态期BmVg基因的转录谱；B：不同浓度保幼激素处理体外培养脂肪体；C：不同浓度蜕皮激素处理体外培养脂肪体；D：0.2μM蜕皮激素分别处理体外培养脂肪体0，6，12，24，48小时）。

图2为BmVg启动子结构示意图（其中粗箭头为BrC-Z2结合基序，转角箭头处为转录起始位点）。

图3为BmVg受蜕皮激素的调控是通过BmBrC-Z2起作用的（A和B：细胞转染分析BrC-Z2结合元件对BmVg启动子应答蜕皮激素的响应；C和D：EMSA实验分析BmBrC-Z2蛋白与预测的结合位点相互作用。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南（第三版，J.萨姆布鲁克等著）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、脂肪体体外培养与激素处理