[发明专利]鉴定菊花耐热相关差异蛋白的方法

说明书

技术领域

本发明涉及蛋白质组学领域，具体地说，涉及一种鉴定菊花耐热相关差异蛋白的方法。

背景技术

菊花是中国十大传统名花和世界四大切花之一，它品种繁多，色彩丰富，花形多变，姿态万千，在世界花卉栽培与应用中的地位极为重要。但其最适生长温度是15～25℃，当温度超过25℃，尤其在夏天，不利于菊花的生长。高温会引起繁殖障碍、花期推迟、基部落叶、株型松散等。因此，鉴定相关基因、了解他们的表达模式及功能成为至关重要的手段，并以此为基础采取有效措施来提高植物的耐热性。

然而，通过差显基因等技术通过基因来获得耐热相关蛋白不仅耗时耗力，也由于从基因水平到蛋白水平会发生很多变化，大大增加了实验难度。而蛋白质组学作为后基因组时代的一个新领域，能从细胞整体水平上对蛋白质结构和功能进行研究，包括蛋白质在细胞内的表达水平、位置、功能和调节，以及翻译后的修饰、剪接等加工信息等来揭示生命的过程和解释基因表达控制的机理。蛋白质组学能比较不同生理环境下不同处理下的全蛋白，能快速准确的鉴定出差异蛋白。

相对和绝对定量同位素标记iTRAQ技术是近年来新研发的一种多肽体外标记技术，能分别进行多达4种和8种不同样品的检测。且iTRAQ试剂几乎可以标记所有蛋白，直接与串联质谱联用，大大提高了实验的精确度、可靠性和可操作度。通过该技术，可以快速鉴定菊花耐热相关的差异蛋白，为快速提高菊花的耐热性提供研究基础。

发明内容

本发明的目的是提供一种鉴定菊花耐热相关差异蛋白的方法。

为了实现本发明目的，本发明的一种鉴定菊花耐热相关差异蛋白的方法，包括以下步骤：

1）选择生长一致、无病虫害的耐热菊花品种和不耐热的菊花品种，分别对它们进行6h热激处理，同时将不进行热激处理的上述耐热菊花品种和不耐热的菊花品种作为对照，然后取热激处理组和对照组叶片，分别用TCA丙酮沉淀法提取蛋白；

2）将四组蛋白样品分别进行定量、纯化和胰蛋白酶酶解，再分别用不同的iTRAQ同位素标签进行标记，去除残留标记试剂并脱盐后，混合四组样品，最后通过多维液相色谱分离和串联质谱联用采集数据，并对所得数据进行生物信息学分析，鉴定出菊花耐热相关差异蛋白。

所述耐热菊花品种包括但不限于菊花脑，所述不耐热的菊花品种包括但不限于地被菊品种“晚粉”。

前述的方法，步骤1）具体为：选择耐热菊花品种和不耐热的菊花品种，取大小一致的脚芽进行扦插繁殖，扦插在按等重量份混合的草炭和珍珠岩的基质中培养3个月；然后将健康、无病虫害的植株移至人工气候培养箱，于白天、黑夜温度为20℃、18℃的条件下培养24h；然后选取部分植株置于白天40℃、相对湿度为75%的条件下热胁迫6h，对照组培养条件为白天20℃、相对湿度为75%；然后随机选取热激处理组和对照组的菊花叶片，分别用TCA丙酮沉淀法提取蛋白。

前述的方法，步骤2）中第一维高pH反相色谱分离的过程为：将混合标记后的样品400μg用50μl流动相A溶解，14000g离心20min，取上清待用；然后用400μg酶解好的BSA进行分离，检测系统情况；再将50μl准备好的样本上样，使用梯度洗脱，0～5min流动相由5%B升至8%B；5～35min流动相由8%B升至18%B；35～62min流动相由18%B升至32%B；62～64min流动相由32%B升至93%B；64～68min保持95%B；68～72min流动相由95%B降至5%B，流速为0.7ml/min。其中，流动相A为：98%ddH₂O，2%乙腈，pH值10；流动相B为：98%乙腈，2%ddH₂O，pH值10。

前述的方法，步骤2）中第二维低pH反相色谱质谱联用数据采集过程为：合并第一维色谱得到的馏分，合并时采用2%ACN和0.1%FA的混合液30μL，加入第一个离心管，涡旋振荡并离心后，转入第二个离心管，依次直至合并组分最后一管；12000转离心10分钟，吸取上清上样；取8μL上样，上样流速为2μL/min，上样15min，肽段直接被捕集柱捕获，并与分析柱相连，同时启动Nano泵进行RP分离，启动质谱采集在线检测肽段；