[发明专利]一种构建TAL效应子和TALENs的简化方法及质粒

权利要求书

1.一种通用载体pSK-RAR-U的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

第一步，以含有avrXa23基因的pBluescript SK+质粒即pSK-avrXa23质粒DNA为模板，分别用引物对TalenF1/TalenR1、TalenF2-U/TalenR2进行PCR扩增，将扩增出的两个PCR产物混合作模板，再用引物对TalenF1/ TalenR2进行搭桥PCR；

第二步，将扩增出的片段回收，与pEASY-Blunt载体重组连接，测序正确的克隆用SphI酶切；

第三步，将酶切片段克隆到中间载体pSK-avrXa23ΔSphF-XH载体，构建成通用的重复可变区受体质粒载体，命名为pSK-RAR-U；

其中，所述TalenF1、TalenR1、TalenF2-U、TalenR2的序列分别是SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.15；

其中，所述中间载体pSK-avrXa23ΔSphF-XH载体构建方法如下：

(1) 将(pSK-avrXa23用SphI酶切，去除SphI酶切的DNA片段，将含有avrXa23的N端和C端DNA序列的载体在T4连接酶作用下自连，形成的载体命名为pSK-avrXa23ΔSphF，其中avrXa23没有SphI片段；

(2) 用引物avrXa23F6和avrXa23R6，以pSK-avrXa23ΔSphF载体为模板进行PCR扩增，扩增片段重组到pBluescript II SK的SmaI酶切线性DNA上，形成的中间载体即为pSK-avrXa23ΔSphF-XH；所述引物avrXa23F6和avrXa23R6的序列分别为SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5。

2.一种如权利要求1所述方法构建获得的通用载体pSK-RAR-U。

3.一种如权利要求2所述的通用载体pSK-RAR-U用于构建dTALEs表达载体的方法，其特征在于包括如下步骤：

第一步，dTALE重复区序列组装；

第二步，将dTALE重复区序列克隆到pSK-RAR-U中。

4.一种如权利要求3所述的方法，其特征在于：

第一步，装配识别A、T、G和/或C的dTALE重复区于中间载体中；

第二步，将中间载体用SpeΙ-NheΙ双酶切，并将含SpeΙ-NheΙ酶切片段回收，再克隆到pSK-RAR-U的NheΙ位点，即构建成dTALEs表达质粒载体。

5.如权利要求2所述的通用载体pSK-RAR-U、如权利要求3或4所述的方法在对生物基因组进行定点激活、敲除或修饰的dTALEs和TALENs方法中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其用于黄单胞杆菌属造成的作物病害。

7.如权利要求5所述的应用，其中所述作物是水稻，所述病害为白叶枯病或细菌性条斑病。