[发明专利]隐孔菌提取物在体内和体外抑制流感病毒

说明书

技术领域

本发明涉及隐孔菌提取物在制备流感病毒抑制剂中的应用。 

背景技术

流感病毒是分节段的单负链RNA病毒，属于正粘病毒科，是传染性、急性发热性呼吸道疾病-流行性感冒的病原体。人流感病毒根据其核蛋白的抗原性，分为甲(A)、乙(B)、丙(C)三型，其中甲型流感病毒多次引起季节性大流行(1918H1N1，1957H2N2，1968H3N2以及2009H1N1)，在1918～1919年的大流行中，全世界至少有2000万～4000万人死于流感。 

目前已应用于临床的抗流感药物包括流感病毒基质蛋白M2离子通道抑制剂金刚烷胺和金刚烷乙胺及神经氨酸酶抑制剂奥司他韦和扎那米韦。M2抑制剂通过抑制M2形成的离子通道的活性而阻止病毒基因组向细胞质内的释放，然而目前流行的所有的甲型流感病毒，包括2009年的甲流H1N1以及季节性流感病毒H3N2，均对M2离子通道抑制剂有抗性。神经氨酸酶抑制剂，如奥司他韦，与病毒的神经氨酸酶结合并抑制其活性，从而抑制新组装的病毒颗粒从细胞中释放；但是近年来，奥司他韦抗性的季节性甲型流感病毒(H1)开始出现，流感病毒的奥司他韦抗性与其神经氨酸酶的单个氨基酸突变(H274Y)有关。2008年，CDC报告称，大多数季节性H1N1分离株对奥司他韦耐受，虽然2009年大流行H1N1多对神经氨酸酶抑制剂敏感，但H274Y突变可能出现在大流行的H1N1病毒株中，并导致奥司他韦耐药，有可能引起一个重大的健康问题，因此有必要开发新的抗流感病毒药物。 

隐孔菌(Cryptoporus volvatus(Peck)Shear)是一种生于松林树干上的野生大型真菌，也有记载生于衰老的冷杉、云杉的树干或枯立木上，该菌为腐生真菌，在野外有较广泛的分布，我国的黑龙江、吉林、福建、浙江、广东、广西、云南、海南岛等省都有生长。在传统中医药中多用于治疗气管炎和哮喘，有舒筋活络，祛风除湿的功效。隐孔菌其野生子实体的药用价值在《滇南本草》、《秦岭巴山天然志》、《新华本草纲要》和《中国药用孢子植物》中都有记载。对于隐孔菌的理化成分进行分析显示其含有多种生理活性物质，比如多糖、多肽、挥发油及隐孔酸等。据报道隐孔菌的提取物具有抗肿瘤、抗炎以及免疫调节功能。 

发明内容

本发明的目的是提供一种对抗流感病毒的天然产物来源。 

隐孔菌提取物在体外有效的抑制流感病毒A/Beijing/7/2009(BJ09)H1N1感染MDCK细胞；应用小鼠模型研究发现提取物可降低病毒感染后肺组织中病毒滴度，保护小鼠免于流感 病毒的致死剂量的感染。这些研究结果表明，隐孔菌子实体的提取物有望开发成新的抗流感病毒的药物。 

附图说明

图1为间接免疫荧光测定隐孔菌水提取物抑制流感病毒H1N1在MDCK细胞内复制的结果。 

MDCK细胞感染流感病毒H1N1(MOI＝0.1)，培养液中含有指定浓度的隐孔菌提取物，24小时后进行间接免疫荧光，检测病毒在细胞内的复制。 

图2为隐孔菌水提取物降低H1N1感染细胞上清中的病毒滴度。 

MDCK细胞感染流感病毒H1N1(MOI＝0.1)，培养液中含有指定浓度的隐孔菌提取物，24小时后收集上清测定病毒滴度。 

图3为用MTT实验确定隐孔菌水提取物对MDCK细胞的毒性。MDCK细胞与不同浓度的隐孔菌水提取物或生理盐水对照孵育48小时，然后MTT检测细胞存活率。以生理盐水对照中细胞存活率为100％。 

图4为隐孔菌乙醇提取物抑制流感病毒H1N1在MDCK细胞内复制。 

MDCK细胞感染流感病毒H1N1(MOI＝0.1)，培养液中含有指定浓度的隐孔菌提取物，24小时后进行间接免疫荧光，检测病毒在细胞内的复制。 

图5为隐孔菌乙醇提取物降低H1N1感染细胞上清中的病毒滴度。 

MDCK细胞感染流感病毒H1N1(MOI＝0.1)，培养液中含有指定浓度的隐孔菌提取物，24小时后收集上清测定病毒滴度。 

图6为用MTT实验确定隐孔菌乙醇提取物对MDCK细胞的毒性。MDCK细胞与不同浓度的隐孔菌乙醇提取物或DMSO对照孵育48小时，然后MTT检测细胞存活率。以DMSO对照中细胞存活率为100％。 

图7为隐孔菌提取物减轻流感病毒H1N1毒株感染小鼠引起的体重降低。 

图8为隐孔菌提取物提高流感病毒H1N1毒株感染小鼠的存活率。 

图9为隐孔菌提取物降低流感病毒H1N1毒株感染小鼠肺脏内的病毒滴度。