[发明专利]一种肉制品中植物源性转基因成分多重荧光定量PCR检测方法和检测试剂盒

权利要求书

1.一种肉制品中植源性转基因成分的多重荧光定量PCR检测方法，包括DNA提取和PCR检测两个步骤，其特征在于：所述的DNA提取步骤为将肉制品样品经剪碎或研磨均质后，按照组织基因组DNA提取方法进行DNA抽提；所述的PCR检测步骤为将所属CaMV 35S启动子、NOS终止子和标记基因NPTII的特异性引物和探针、预混荧光定量PCR反应体系、DNA模板和ddH₂O按一定比例用量加入荧光定量PCR反应管，再将荧光定量PCR反应管放入荧光定量PCR仪进行扩增，扩增结束后搜集荧光信号，同时进行平行试验。

2. 根据权利要求1所述的肉制品中植源性转基因成分的多重荧光定量PCR检测方法, 其特征在于：所述的所属CaMV 35S启动子、NOS终止子和标记基因NPTII的特异性引物和探针的碱基排列顺序为：

CaMV 35S

反向引物: 5′- CGACAGTGGTCCCAAAGA - 3′

正向引物: 5′- AAGACGTGGTTGGAACGTCTTC - 3′

探针：5′FAM-TGGACCCCCACCCACGAGGAGCATC- TAMRA 3′；

NOS

反向引物: 5′- TCT TAAGATTGAA TCCTGTT - 3′  

正向引物: 5′- ATTGCGGGACTCTAATCATA - 3′

探针：5′HEX-CAGAAATTATATGATAATCATCGCAAGTCC –TAMRA 3′；

NPTⅡ   

反向引物: 5′- AGGATCTCGTCGTGACCCAT - 3′

正向引物: 5′- GCACGAGGAAGCGGT - 3′

探针：5′ROX-CACCCAGCCGGCCACAGTCGAT-TAMRA 3′。

3. 根据权利要求 1所述的肉制品中植源性转基因成分的多重荧光定量PCR检测方法，其特征在于：所述的PCR检测步骤中各组分的加入量如下表所示：

。

4.根据权利要求1所述的肉制品中植源性转基因成分的多重荧光定量PCR检测方法，其特征在于：所述的DNA模板为标准品或提取的DNA；所述DNA模板为标准品时作为阳性对照管； 所述DNA模板为提取的DNA时作为测试管。

5. 根据权利要求1所述的肉制品中植源性转基因成分的多重荧光定量PCR检测方法，其特征在于：所述标准品序列应包含以下序列：

CaMV 35S：AAGACGTGGTTGGAACGTCTTCTTTTTCCACGATGCTCCT CGTGGGTGGG GGTCCATCTTTGGGACCACTGTCG；

NOS:TCTTAAGATTGAATCCTGTTGCCGGTCTTGCGATGATTATCATTAATTTCTGTTGAATTACGTTAAGCATGTAATAATTAACATGTAATGCATGACGTTATTTATGAGATGGGTTTTTATGA TTAGAGTCCC GCAATTA；

NPTⅡ：GCACGAGGAAGCGGTCAGCCCATTCGCCGCCAAGCTCTTCAGCAATATCA CGGGTAGCCAACGCTATGTCCTGATAGCGGTCCGCCACACCCAGCCGGCCACAGTCGATGAATCCAGAAAAGCGGCCATTTTCCACCATGATATTCGGCAAGCAGGCATCGCCATGGGTC ACGACGAGAT CCT。

6. 根据权利要求1所述的肉制品中植物源性转基因成分多重荧光定量PCR检测方法，其特征在于：所述的荧光定量PCR仪设置的反应参数为95℃变性1min30s， 以95℃5s, 58℃30s, 72℃30 s扩增40个循环，设置58℃结束后开始收集荧光信号。

7. 一种权利要求1所述的肉制品中植物源性转基因成分多重荧光定量PCR检测方法中使用的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括转基因调控元件、预混荧光定量PCR反应体系、标准品和ddH₂O；所述的转基因调控元件包括所属CaMV 35S启动子、NOS终止子和标记基因NPTII的特异性引物和探针；所述的标准品包括CaMV 35S启动子、NOS终止子和标记基因NPTII的目标扩增片段。