[发明专利]一种快速检测革兰氏菌的方法及试剂盒无效
| 申请号： | 201410033894.4 | 申请日： | 2014-01-23 |
| 公开（公告）号： | CN103792351A | 公开（公告）日： | 2014-05-14 |
| 发明（设计）人： | 马旭东;陈新华;范世峰;殷胜勇;于中丽;杨阳;巫兰 | 申请（专利权）人： | 新疆纳秒脉冲技术应用研究所 |
| 主分类号： | G01N33/569 | 分类号： | G01N33/569 |
| 代理公司： | 乌鲁木齐新科联知识产权代理有限公司 65107 | 代理人： | 欧咏 |
| 地址： | 830026 新疆维吾尔自治*** | 国省代码： | 新疆;65 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 快速 检测 革兰氏菌 方法 试剂盒 | ||
1.一种快速检测革兰氏菌的方法，其特征在于：分步实施；
1）革兰氏菌培养；
2）用纳秒脉冲对细菌进行低温灭活处理，提取革兰氏阳性菌磷壁酸抗原和革兰氏阴性菌脂多糖抗原；
其中制备革兰氏阳性菌膜抗原：将金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC25923，37℃培养12h后收集菌落，经300ns的脉冲处理灭活后，超声裂解，在15000rpm条件下，离心15min，再经冷苯酚抽提用CNB2层析柱层析获得,制备好后，储存在-80℃低温保存，备用；
其中制备革兰氏阴性菌膜抗原：将大肠埃希氏菌标准菌株ATCC25922，37℃培养12h后收集菌落，经300ns的脉冲处理灭活后，超声裂解，在15000rpm条件下，离心15min，再经曲通114表面活性剂抽提，加温至72℃，再在15000rpm离心条件下，离心15min，过滤，取上清液过sephadexG-200分子筛纯化制得，制备好，储存在-80℃低温保存，备用；
3）将提取的两种抗原及质控血清点在制备好的硝酸纤维膜反应板上；
用移液器在硝酸纤维膜的固定位置上分别点入，革兰氏阴性菌膜抗原的2个检测点和1个点入30个正常的混合血清的质控点，点膜量1-10ul，革兰氏阳性菌膜抗原浓度0.7-2.2mg/ml，革兰氏阴性菌膜抗原浓度0.3-0.8mg/ml,点膜后37℃烘烤1h，置4℃冷藏保存，备用；
其中硝酸纤维膜经10%的甲醇浸泡10min,取出裁剪，将其安装在垫有吸水垫的PVC反应板的孔中，37℃烘烤2h后使用；
其中硝酸纤维膜上的2个检测点和1个质控点从左到右依次按照革兰氏阳性菌膜抗原检测点、正常血清质控点、革兰氏阴性菌膜抗原检测点的次序排列而成；
4）采用斑点免疫金渗滤技术检测抗体，判断样品是否含有磷壁酸抗体及脂多糖抗体。
2.一种快速检测革兰氏菌的试剂盒，其特征在于：试剂盒由反应板、样本稀释液、洗涤液和金标抗体液构成；
反应板:是将反应膜安装在垫有吸水垫的PVC底板的反应孔中制成；
样本稀释液：用1mmol/L，pH 8.5的Tris-HCL缓冲液50ml、吐温20 25ul、明胶 1ml，超纯水定容至100ml，制得；
洗涤液：用1mmol/L，pH 8.5的Tris-HCL缓冲液50ml、吐温20 500ul、Nacl 2g，超纯水定容至100ml，制得；
金标抗体液：采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金，胶体金颗粒直径0.22um；胶体金溶液pH 6.7、吸光值0.08-0.15，将胶体金标记羊抗人IgG抗体，羊抗人IgG浓度1-4mg/ml，制得金标抗体液。
3.依据权利要求1所述的方法，其特征在于：选用的革兰氏阳性菌膜抗原是金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC25923磷壁酸抗原，分子量10-100kda；选用的革兰氏阴性菌膜抗原是大肠埃希氏菌标准菌株ATCC25922脂多糖抗原，分子量10-100kda。
4.依据权利要求2所述试剂盒，其特征在于：选用的Tris-HCL、吐温20、羊抗人IgG均购自美国Sigma试剂公司。
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