[发明专利]中华大蟾蜍抗菌肽BG-SK14及其编码基因和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物医学领域，具体涉及中华大蟾蜍抗菌肽BG-SK14及其编码基因和应用。

背景技术

中华大蟾蜍为无尾两栖类蟾蜍属动物，广泛分布于我国大部分地区，是传统中药蟾酥和蟾皮的主要基源动物，有具有解毒散结、消积利水、杀虫消疳的功效。从中华大蟾蜍Bufo bufo gargarizans Cantor的干燥皮提取精制而成的水溶性制剂-华蟾素，目前广泛应用于多种中晚期肿瘤，如原发性肝癌、胃癌、肺癌、结肠癌、胰腺癌等。

国内外学者发现两栖动物皮及其分泌物含有丰富的抗菌肽，这类多肽通常含有10～50个氨基酸残基，成熟的多肽来源于前体蛋白的水解，大多数抗菌肽由于富含碱性氨基酸而带净正电荷。抗菌肽具有很多优点：消炎、抗感染、抗真菌、抗肿瘤、促进伤口愈合等作用，这些功能使抗菌肽可能成为良好应用前景的临床候选药物。

发明内容

本发明的目的是提供了中华大蟾蜍抗菌肽BG-SK14及其编码基因和应用，所述抗菌肽BG-SK14具有显著的抗肿瘤作用，其具有结构简单、合成成本低和抗菌谱系广等优点。

为了实现本发明的目的，本发明提供了如下技术方案：

中华大蟾蜍抗菌肽BG-SK14，其具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。

含有所述的中华大蟾蜍抗菌肽BG-SK14的蛋白前体，其具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

所述的中华大蟾蜍抗菌肽BG-SK14的蛋白前体的编码基因，其具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

所述的中华大蟾蜍抗菌肽BG-SK14的蛋白前体的编码基因，使用T7启动子序列和SP6启动子序列筛选获得所述编码基因，

所述T7启动子序列为5’-TAATACGACTCTATAGGGA-3’；

所述SP6启动子序列5’-CATACGATTTAGGTGACACTATAG-3’。

本发明还提供了所述的中华大蟾蜍抗菌肽BG-SK14在制备用于抗肿瘤的药物中的应用。

所述抗菌肽BG-SK14在12.5ug/ml时，对肝癌细胞的抑制效果显著。

所述抗菌肽BG-SK14在3.125μg/ml时，对乳腺癌细胞的抑制效果显著。

所述抗菌肽BG-SK14在3.125μg/ml时，对脑神经瘤细胞的抑制效果显著。

与现有技术相比，本发明的优点和技术效果是：本发明在中华大蟾蜍毒液腺cDNA文库中获得了具有广谱抗菌活性的抗菌肽BG-SK14，将所述抗菌肽BG-SK14全序列氨基酸序列经蛋白质数据库进行搜寻比较，未发现有任何相同的成熟肽，所述抗菌肽BG-SK14具有创新性。

本发明通过实验证明两栖动物来源的中华大蟾蜍抗菌肽BG-SK14具有显著的抗肿瘤的作用，尤其是对临床肿瘤细胞有很好的抑制作用，而且抗肿瘤范围广泛，与其它来源的抗菌多肽相比，该组抗菌肽具有结构简单、人工合成方便、抗菌谱系广的有益特点，可以应用于抗微生物感染和抗肿瘤的药物的制备，用于人和动物的治疗。具有良好的市场应用前景。

附图说明

图1是本发明中华大蟾蜍抗菌肽BG-SK14的cDNA及其蛋白质序列，其中斜体加框序列为推导的中华大蟾蜍抗菌肽BG-SK14的成熟序列。

图2表明本发明抗菌肽BG-SK14对肝癌细胞HepG2的作用。

图3表明本发明抗菌肽BG-SK14对乳腺癌细胞MCF-7的作用。

图4表明本发明抗菌肽BG-SK14对脑神经瘤细胞Neuro-2a的作用。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细的说明。

实施例1

一、中华大蟾蜍抗菌肽BG-SK14的基因克隆

1、总RNA的提取

将中华大蟾蜍放于玻璃烧杯中，加入几滴乙醚，收集毒液腺分泌物（也可以直接使用收集好的毒液腺分泌物），立即放入液氮中。称重后取20mg分泌物于液氮中研磨至粉末状。加入10ml总RNA提取缓冲液（Trizol溶液，美国GIBCO/BRL产品），于20ml玻璃匀浆器中匀浆30分钟。然后加入等体积的酚/氯仿溶液，剧烈混匀。室温放置10分钟后，4℃,12000rpm离心10分钟，弃沉淀，上清液加入等体积的异丙醇，室温放置10分钟。4℃,12000rpm离心10分钟，沉淀用75%乙醇洗一次，晾干，管底沉淀物即为总RNA。

2、mRNA的分离