[发明专利]荧光比率法检测次氯酸的荧光探针及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种荧光检测方法，尤其是涉及一种将硫代香豆素作为荧光探针应用于检测细胞内产生的活性氧物种次氯酸(HClO)的荧光比率法检测次氯酸的荧光探针及其制备方法。

背景技术

活性氧是生物体产生的一系列化学性质活泼、氧化能力强的含氧物质的总称。活性氧不仅包括一些自由基,如羟自由基(·OH)、超氧阴离子(O₂^-·)、过氧自由基(ROO·)等，也包括一些非自由基,如过氧化氢(H₂O₂)、单线态氧(¹O₂)和次氯酸(HOCl)等。

与其他的活性氧物种不同，HClO在人们的日常生活中随处可见。例如，次氯酸钠在160多年前便被人们用作消毒剂的主要有效成分。而生物体内源性HClO由髓过氧化物酶（MPO）介导产生，是一种重要的功能强大的氧化剂，在生理状态下发挥抗微生物效应，起到保护机体的作用。最近的研究表明，HClO还是天然的适应性免疫佐剂。然而，在特定条件下,假如MPO催化反应所产生的HClO过量,超过局部抗氧化剂的防御反应时,将导致氧化应激和氧化性组织损伤。已证实，过量HClO引起的氧化应激与白血病、肾炎、小血管炎、肿瘤及动脉粥样硬化等多种疾病相关，其中，HClO与动脉粥样硬化疾病的相关性是人们近年来的研究热点。

基于HClO在生理、病理过程的重要作用，发展高性能的HClO荧光探针，为进一步研究其在生物学过程中的分子和细胞事件提供探测工具，为疾病的发病机制、诊断及干预的研究提供可靠信息，具有重要意义。

目前，已报到的次氯酸荧光探针在应用中大都基于单波长发射的荧光信号变化（通常是增强）[J.Am.Chem.Soc.,2007,129,7313.；Org.Lett.,2009,11,(4),859.；Chem.Biol.,2007,14,1221.]，这些荧光探针在对细胞内目标物进行定性、定位以及示踪等方面很好地满足了人们的要求。然而，随着研究的深入，人们更希望进一步获得生物微环境系统中有关目标物的定量信息。

荧光强度是一个相对的度量单位，要获得关于被分析物的定量的数据，就需要对在实验过程中影响荧光强度的各种参素中除被分析物的浓度以外的其它参数进行校正。在桌面实验的荧光的测试中，上述问题可以简单地通过已计量好的标准样建立的标准工作曲线来进行校正而加以解决。但是对于单细胞内的微系统检测而言，通常的单发射波长探针却是无法实现的。例如，我们无法知道探针分子在不同细胞中的具体分布，又如，影响探针荧光强度的其它因素，如随着照射时间产生的光致变性和光漂白等，存在差异性。因而需要在每个测量点上均建立一个标准函数，而这是很难做到的。显然，通常的单波长发射的荧光探针仅依赖于一个信息通道内的荧光强度的变化，很难在微环境中实现准确的定量测量。

因此，如果我们要得到细胞微环境中被分析物的定量信息，就需要建立另外一套方法，也就是让每个探针在分子水平上建立内部的标尺，使之都具有自动校准功能。这意味着需要在原有的发射波长信号通道(λ1)以外，引入第二个发射波长信号通道(λ2),通过双波长荧光信号的比值的测量，则能够减少或消除若干因素的变化对荧光强度测量的影响，包括探针浓度、激发光的光路长度、激发强度和检测效率等，以及人工假象包括光漂白、探针渗漏、细胞厚度、探针在细胞内（区室化作用引起）或不同细胞群之间（负载效率差异造成）的不均匀分布等，从而获得准确定量的信息，该方法称为荧光比率法。

迄今为止，涉及HClO的荧光比率探针研究报道甚少[Chem.Eur.J.2009,15,2305-2309.]。

发明内容

本发明的目的在于针对已报道的细胞内次氯酸（HClO）荧光探针存在的不足，提供一种高灵敏、高选择性的荧光比率法检测次氯酸的荧光探针及其制备方法。

所述荧光比率法检测次氯酸的荧光探针的结构式为：

所述荧光比率法检测次氯酸的荧光探针的合成路线为：

所述荧光比率法检测次氯酸的荧光探针的制备方法，其具体步骤如下：